李曉波,付 瑞,王 吉,衛(wèi) 禮,王淑菁,岳秉飛,賀爭(zhēng)鳴

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用

李曉波,付 瑞,王 吉,衛(wèi) 禮,王淑菁,岳秉飛,賀爭(zhēng)鳴

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

目的 建立小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法并對(duì)方法進(jìn)行初步應(yīng)用。方法 根據(jù)NCBI發(fā)表的TMEV GD VII株（GI：62039）基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，建立RT-PCR方法，驗(yàn)證方法的敏感性和特異性；腦腔接種方式感染9只BALB/c小鼠，感染后第6天采集動(dòng)物的腦、心、肝、脾、肺、腎、盲腸內(nèi)容物和血清等樣本，用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)檢測(cè)100份小鼠盲腸內(nèi)容物樣本，對(duì)方法進(jìn)行初步應(yīng)用。結(jié)果 以GD VIIRNA為模板，建立的RT-PCR方法能夠擴(kuò)增出約371bp的單一目的條帶，敏感性驗(yàn)證顯示能夠檢測(cè)到的最低GD VII cDNA量為0.69pg/μL；以腦心肌炎病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、日本乙型腦炎病毒、小鼠諾如病毒及正常小鼠腦組織為對(duì)照進(jìn)行方法特異性驗(yàn)證，均未出現(xiàn)目的條帶。腦腔接種感染小鼠，所有小鼠在接種第3天均產(chǎn)生不同程度的精神萎靡后肢麻痹等癥狀，其中2只小鼠于第5天死亡；采集心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內(nèi)容物及血清等樣本進(jìn)行檢測(cè)，所有小鼠的腦組織均檢測(cè)到GD VIIRNA，而其他組織均未檢測(cè)到；對(duì)100份小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。結(jié)論 建立的TMEV GDVII株RT-PCR方法能夠高效的檢測(cè)小鼠組織中的病毒感染，可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充。

Theiler氏腦脊髓炎病毒；GDVII；腦腔接種；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

小鼠腦脊髓炎病毒（mouse encephalomyelitis virus，MEV）又稱 Theiler氏小鼠腦脊髓炎病毒（theilerˊsmouse encephalomyelitis virus，TMEV），分類上屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，主要侵害小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多數(shù)呈隱性感染，有時(shí)表現(xiàn)腦脊髓炎和后肢麻痹等癥狀［1-3]。目前已從世界各地分離到多個(gè)毒株，根據(jù)其毒力的不同分為兩個(gè)亞群：高毒力亞群以GDVII和FA株為代表，可引起急性致命性腦炎；低毒力亞群引起持續(xù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和炎性脫髓鞘［2，4]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)將TMEV列為SPF小鼠檢測(cè)項(xiàng)目之一。

本實(shí)驗(yàn)建立了TMEV的RT-PCR檢測(cè)方法，通過對(duì)病毒感染動(dòng)物組織樣本的檢測(cè)以及小鼠自然感染情況的監(jiān)測(cè)，對(duì)方法進(jìn)行了初步應(yīng)用，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以作為動(dòng)物中TMEV檢測(cè)的常規(guī)方法，是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)檢測(cè)技術(shù)的有力補(bǔ)充。

1 材料和方法

1.1 試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑為Sigma產(chǎn)品；PCR相關(guān)試劑購自Takara公司；RNA提取試劑盒為 QIAGEN產(chǎn)品；Trizol試劑為invitrogen公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇等其他化學(xué)試劑為北京化工。

1.2 病毒毒株

TMEV GDVII株購自ATCC，小鼠腦心肌炎病毒（mouse encephalomyocarditis virus，EMCV）、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCM）、乙型腦炎病毒（Japanese B encephalitis virus，JEV）及鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）均為本室保存。

1.3 BALB/c小鼠

SPF級(jí)，3周齡，雌性，共10只，來自本院動(dòng)物供應(yīng)室【SCXK（京）2014-0013】，使用許可證號(hào)【SYXK（京）2011-0008】。

1.4 動(dòng)物樣本

100份小鼠盲腸內(nèi)容物樣品來自2014年10月北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)檢各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位。

1.5 方法

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI發(fā)表的TMEV GDVII株（GI：62039）基因組序列，選取保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 GD VIIRT-PCR引物Tab.1 Primers for the GD VIIRT-PCR

1.5.2 病毒RNA的提?。篢MEV GDVII株BHK21細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)三次凍融后，分別取200μL按試劑盒的操作說明提取RNA，其他對(duì)照病毒也按照該方法進(jìn)行。

1.5.3 RT-PCR方法的建立及反應(yīng)條件優(yōu)化：首先逆轉(zhuǎn)錄提取的TMEV RNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR反應(yīng)體系dNTP濃度、DNA聚合酶量、引物濃度及退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.5.4 敏感性測(cè)定：紫外分光光度法測(cè)定TMEV cDNA模板濃度，然后進(jìn)行10-1～10-10系列稀釋，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)方法的靈敏度。

1.5.5 特異性測(cè)定：分別以 TEMV，EMCV，LCM，JEV，MNV及正常小鼠腦組織所提取的RNA為模板，用建立的RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證方法的特異性。

1.5.6 初步應(yīng)用

1.5.6.1 感染試驗(yàn)：10只BALB/c小鼠，9只腦腔注射30μL TMEV病毒液，另外1只作為PBS對(duì)照，逐日觀察，于感染后第6天對(duì)所有動(dòng)物施行安樂死，取心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內(nèi)容物和血清等樣本，心、肝、脾、肺、腎、腦等組織用 Trizol試劑法提取RNA，盲腸內(nèi)容物和血清參照1.5.2用RNA試劑盒提取RNA，隨后用建立的RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5.6.2 樣本篩查：100份小鼠盲腸內(nèi)容物，取100 mg加入900μL滅菌PBS，漩渦震蕩后10000 r/min離心 5 min，取 200μL上清按試劑盒說明提取RNA，隨后用建立的RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR反應(yīng)體系及條件

25μL逆轉(zhuǎn)錄體系包括5×RT buffer 5μL，dNTP 4μL，隨機(jī)引物1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各0.5μL，RNA模板8μL，無RNA酶水6μL；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37℃ 90 min，72℃ 15 min，4℃ 5 min各1個(gè)循環(huán)。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為10× PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，HSTaq酶0.5μL，最后加滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件為94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序

提取TMEV GDⅦ株細(xì)胞培養(yǎng)物RNA，用建立的雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，序列經(jīng)NCBIBlast比對(duì)，符合率均為99％。

2.3 敏感性測(cè)定

紫外分光法測(cè)得TMEV cDNA模板濃度為690 ng/μL，由圖1可見，建立的TMEV RT-PCR方法所能檢測(cè)的最大稀釋度為10-6，即該方法所能檢測(cè)的最低cDNA濃度為0.69 pg/μL。

圖1 TMEV RT-PCR方法敏感性Note：M：100 bp marker；1 to10：10-1 to 10-10 dilution of TMEV cDNA.Fig.1 Sensitivity of TMEV RT-PCR

2.4 特異性測(cè)定

用建立的 RT-PCR方法分別擴(kuò)增 TEMV，EMCV，LCM，JEV，MNV及正常小鼠腦組織，結(jié)果以TMEV為模板產(chǎn)生371 bp的特異條帶，以其他對(duì)照病毒及正常小鼠腦組織為模板均不產(chǎn)生特異條帶（圖2）。

圖2 TMEV RT-PCR方法特異性Note：M：100 bp marker；1 to 7：TMEV，EMCV，LCM，JEV，MNV，normalmouse brain tissue，sterile ddH2O.Fig.2 Specificity of TMEV RT-PCR

2.5 初步應(yīng)用

2.5.1 感染實(shí)驗(yàn)

感染小鼠于感染第3天產(chǎn)生不同程度的臨床癥狀，比較對(duì)照小鼠表現(xiàn)為明顯發(fā)育不良，后肢麻痹、精神萎靡（圖3），其中2只小鼠于感染后第5天死亡。對(duì)感染小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內(nèi)容物及血清等組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有小鼠腦組織均產(chǎn)生371bp的目的條帶，其他組織均未出現(xiàn)目的條帶（部分結(jié)果見圖4）。對(duì)腦組織PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，與TMEV（GI：62039）的符合率為100％。

2.5.2 樣本篩查：對(duì)會(huì)檢的100份小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行TMEV RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。

3 討論

腦脊髓炎病毒在動(dòng)物中的感染時(shí)有報(bào)道，不僅能夠感染小鼠，也可以感染大鼠，且感染率較高［5-10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)中TMEV的檢測(cè)方法主要為血清學(xué)方法，本實(shí)驗(yàn)建立了TMEV的RT-PCR方法，與以往報(bào)道的分子生物學(xué)方法相比［11]，不需要進(jìn)行后續(xù)的探針檢測(cè)，用時(shí)短，且敏感性更高，特異性更好。

報(bào)道［12]，本實(shí)驗(yàn)在腦腔注射感染小鼠的過程中采用眼角斜上方淺進(jìn)針（2 mm）的方式進(jìn)行注射，減少了對(duì)動(dòng)物腦部的損傷。實(shí)驗(yàn)用的TMEV毒株為強(qiáng)毒株GDVII，感染動(dòng)物在第3天均出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，變現(xiàn)為后肢癱瘓、震顫等，其中2只于感染第5天死亡。用建立的RT-PCR方法對(duì)感染小鼠的組織進(jìn)行檢測(cè)，所有感染動(dòng)物的腦組織均檢測(cè)到GDVII核酸，在肺組織產(chǎn)生約400 bp的非特異條帶，經(jīng)測(cè)序排除了TMEV，其他組織均未檢測(cè)到，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致［13-14]，可能病毒未通過血腦屏障，因而未感染到其他器官。

圖3 感染小鼠后肢癱瘓

圖4 感染小鼠組織RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Note：M：100 bp marker；1 to 8：Heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，serum，cecal contents；9：Positive control；10：Sterile ddH2O.Fig.4 The results of RT-PCR for tissues of infected mice

對(duì)100份小鼠的盲腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行TMEV的篩查，結(jié)果均為陰性，初步表明近年北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中TMEV的控制情況良好。

綜上所述，我們建立的TMEV RT-PCR方法具有良好的敏感性和特異性，可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)的補(bǔ)充檢測(cè)方法。

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Development and application of RT-PCR for detection of TMEV

LIXiao-bo，F(xiàn)U Rui，WANG Ji，WEILi，WANG Shu-jing，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
（Laboratory Animal Institute，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective To develop RT-PCR for detection of TMEV and apply the method.M ethods To design specific primers on the basis ofGD VII（GI：62039）genome sequences published in NCBIand establish RT-PCR.To verify the sensitivity and specificity ofmethod after optimizing PCR.We infected 9 BALB/c mice intracerebrally and collected brain，heart，liver，spleen，lung，kidnet，cecal contents and serum samples the 6thday postinfection.The samples were tested by the TMEV RT-PCR.100 mouse cecal contents samples were also detected to apply the established method.Results The 371bp single band was amplified using GDVIIas template.Sensitivity test showed that the RT-PCR method can detect as low as 0.69 pg/μLGDVII cDNA.There were no objective band amplified when encephalomyocarditis virus，lymphocytic choriomeningitis virus，Japanese B encephalitis virus，murine norovirus and normalmouse brain tissue were used as case-control.All infectedmice showed symptom of different degrees such as depression and hind limb paralysis the 3th day postinoculation and two of infected mice died the 5th day postinoculation.Tissues such as heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，cecal contents and serum were collected and tested for TMEV.All the brain samples were detected positive for GDVIIand other tissues were all negative；The 100 cecal contents samples were tested and all were negative.Conclusions RT-PCR for TMEV GDVIIstrain can detect virus infection inmouse tissues efficiently and can be used as a powerful supplement for the national standard of lab animal.

TMEV；GDVII；Intracerebral inoculation；RT-PCR

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0017-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.004

國(guó)家科技支撐計(jì)劃“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系的完善與檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究”（2013BAK11B00）。

李曉波（1980-），助理研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué).E-mail：lxb8493059@163.com。

賀爭(zhēng)鳴（1957-），研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。E-mail：zhengminghe57@163.com。

﹞2015-08-31

研究報(bào)告