鮑 丹,董 偉,張 旭,劉 寧,高 珊,張海濤,高 翔,葛文平,呂 丹

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

降鈣素基因相關(guān)肽轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及血壓動態(tài)分析

鮑 丹,董 偉,張 旭,劉 寧,高 珊,張海濤,高 翔,葛文平,呂 丹

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的 建立降鈣素基因相關(guān)肽α（calcitonin gene-related peptide，CGRPα）和β（CGRPβ）轉(zhuǎn)基因小鼠，并對其血壓進(jìn)行動態(tài)對比分析，建立可用于高血壓研究的動物模型。方法 把人CGRPα和CGRPβ基因分別插入雞β-肌動蛋白啟動子下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，顯微注射法建立C57BL/6JCGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。采用Western Blot鑒定CGRPα和CGRPβ在心臟、肺、腎臟和肝臟組織中的表達(dá)，篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)基因品系。用無創(chuàng)血壓測量儀分析轉(zhuǎn)基因小鼠動態(tài)血壓變化。結(jié)果 建立了在心臟、肺、腎臟和肝臟組織中均高表達(dá)CGRPα基因的CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠；在肺和肝臟組織中高表達(dá)CGRPβ基因的CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠。CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常，CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠在12月齡時表現(xiàn)出顯著的血壓降低。結(jié)論 CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠可作為用于CGRP對外周血管阻力和高血壓抵抗機(jī)制研究的動物模型。

CGRP；轉(zhuǎn)基因；外周血管阻力；高血壓抵抗

動脈血壓的形成有賴于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)足夠的血液充盈、心臟射血和外周阻力三種因素的相互作用。影響動脈血壓的因素包括每搏輸出量、心率、外周阻力、大動脈管壁的彈性和循環(huán)血量與血管系統(tǒng)容量的比例，其中，外周阻力增大是慢性高血壓患者血壓升高的原因之一［1-3]。外周血管阻力主要受交感神經(jīng)腎上腺素能神經(jīng)和非腎上腺素能非膽堿能（nonadrenergic noncholinergic，NANC）血管擴(kuò)張神經(jīng)共同調(diào)控［4-5]。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種主要的NANC血管擴(kuò)張神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)［6]，在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、感覺C纖維［7]、肺的淋巴組織［8]、心臟和血管［9]中表達(dá)。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和高血壓患者體內(nèi) CGRP水平顯著降低［10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP對心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，如抗高血壓、抗血小板聚集和抗缺血-再灌注損傷等［12-14]。哺乳動物的 CGRP有 CGRPα和CGRPβ兩個亞型，分別由同一個染色體上的兩個獨(dú)立的基因編碼，兩個亞型的第3、22和25位上的氨基酸序列不同，但二者的生物學(xué)功能相似［15-17]。研究證實(shí)，CGRPα基因敲除小鼠平均動脈血壓（mean arterial pressure，MBP）顯著升高［18]。在日本人群中，CGRPα是原發(fā)性高血壓的易感基因［19]。

基于上述研究結(jié)果，本研究擬通過建立CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠，并對其血壓進(jìn)行動態(tài)分析，為研究CGRP與高血壓發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6J小鼠和ICR小鼠均購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-0001】。CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠由本實(shí)驗(yàn)室制作。本實(shí)驗(yàn)所用動物均在屏障設(shè)施的飼養(yǎng)間【SYXK（京）2009-0003】飼養(yǎng)，飼養(yǎng)間溫度23±2℃，12：12 h明/暗燈照，動物自由飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)中涉及動物操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（ILAS-GC-2012-001）。

1.1.2 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶以及PCR相關(guān)試劑均購自中國寶生物工程有限公司。PCR引物由中國上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。NC膜購自 Millipore公司。鼠抗 CGRPα和 CGRPβ抗體均購自德國Abnova公司。HRP-偶聯(lián)的羊抗鼠抗體和HRP-偶聯(lián)的GAPDH單克隆抗體均購自中國康成生物公司。BP-98A智能無創(chuàng)血壓計購自日本 SoftronTM公司。普通維持飼料購自中國軍事科學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 CGRPα和 CGRPβ表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

以pCR4-TOPO-h-CGRPα質(zhì)粒（GE healthcare，美國，Clone ID 7939598）為模板，用PCR法擴(kuò)增人CGRPα全長 cDNA，上 游 引 物 為：5’CCCT CGAGCAGAGAGGTGTCATGGGCTTC，下游引物為：5’CGGAATTCGGAAAGGGAGGAGTTTAGTTGGC。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)變性到延伸29次，完成30個循環(huán)。目的基因人CGRPα片段為452 bp。將擴(kuò)增片段插入pMD18T載體，經(jīng)測序并比對正確后，以Xho I和EcoR I酶切回收CGRPα片段，并克隆入CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動子下游構(gòu)建全身表達(dá)人CGRPα表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，再用Pvu II將其線性化，Sephedex G50柱純化DNA片段，獲得CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動的人CGRPα基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

以pDNR-LIB-h-CGRPβ質(zhì)粒（GE healthcare，美國，Clone ID 4287225）為模板，用 PCR法擴(kuò)增人CGRPβ全長 cDNA，上游引物為：5’CCCTCGAG AGAGGCGGCATGGGTTTC，下游引物為：5’CGGAA TTCGTCATTCATCTGCTCAGGCTTG。反 應(yīng) 條 件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)變性到延伸29次，完成30個循環(huán)。目的基因人CGRPβ片段為406 bp。將擴(kuò)增片段插入 pMD18T載體，經(jīng)測序并比對正確后，以Xho I和EcoR I酶切回收CGRPβ片段，并克隆入CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動子下游構(gòu)建全身表達(dá)人CGRPβ表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，再用Pvu II將其線性化，Sephedex G50柱純化DNA片段，獲得CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動的人CGRPβ基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2.2 PCR鑒定CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。CGRPα上游引物為：5’CTCTCAGCATCTTGGTCCTG，下游引物為：5’GGTCTCTCTCCAAGTCGCT；CGRPβ上游引物為：5’ATGGGTTTCCGGAAGTTCT，下游引物為：5’AGGCTTGAAGGTCCCTGC。PCR反應(yīng)體系為 20 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)變性到延伸29次，完成30個循環(huán)。目的基因CGRPα片段為357 bp，目的基因CGRPβ片段為384 bp。

1.2.3 Western blot鑒定CGRPα和CGRPβ蛋白的表達(dá)

提取首建鼠仔代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩轉(zhuǎn)基因陰性（non-transgenic，NTG）小鼠心臟、肺、腎臟和肝臟組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上，置于 5％脫脂奶粉中封閉，鼠抗CGRPα和CGRPβ抗體檢測鼠源CGRPα和CGRPβ以及轉(zhuǎn)入的人源CGRPα和CGRPβ蛋白的表達(dá)水平，HRP-偶聯(lián)的羊抗鼠抗體結(jié)合一抗，HRP-偶聯(lián)的GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參。用Image J分析軟件測定Western Blot條帶灰度。

1.2.4 智能無創(chuàng)血壓計測量CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠血壓

將待測小鼠提前半小時放入血壓測量實(shí)驗(yàn)室，讓小鼠適應(yīng)測試環(huán)境。按智能無創(chuàng)血壓計說明書［20]和Steven E.［21]報道的方法于2、4、8和12月齡進(jìn)行小鼠尾部血壓測量。

1.2.5 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±S.E.M.表示，用one-way ANOVA分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

測序結(jié)果表明PCR法克隆的片段同已報道人組 織 CGRPα 序 列 完 全 一 致 （GeneBank：BC093753.1），將人CGRPα基因插入CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動子下游，構(gòu)建得到人CGRPα轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體（圖1A）并用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。提取小鼠基因組DNA，用PCR法擴(kuò)增357 bp的CGRPα基因目的片段，鑒定小鼠基因型（圖1B）。提取小鼠心臟、肺、腎臟和肝臟組織總蛋白，用CGRPα抗體進(jìn)行Western Blot分析，確定轉(zhuǎn)基因小鼠CGRPα的高表達(dá)（圖1C）。Image J軟件分析條帶灰度，定量分析CGRPα蛋白表達(dá)量（圖1D）。通過分別比較NTG和轉(zhuǎn)基因小鼠中CGRPα表達(dá)水平，篩選到在心臟、肺、腎臟和肝臟組織中都高表達(dá)CGRPα基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

2.2 CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

測序結(jié)果表明PCR法克隆的片段同已報道人組 織 CGRPβ 序 列 完 全 一 致 （GeneBank：BC008428.1），將人CGRPβ基因插入CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白啟動子下游，構(gòu)建得到人CGRPβ轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體（圖2A）并用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。提取小鼠基因組DNA，用PCR法擴(kuò)增384 bp的CGRPβ基因目的片段，鑒定小鼠基因型（圖2B）。提取小鼠肺和肝臟組織總蛋白，用CGRPβ抗體進(jìn)行Western Blot分析，確定轉(zhuǎn)基因小鼠CGRPβ的高表達(dá)（圖2C）。Image J軟件分析條帶灰度，定量分析CGRPβ蛋白表達(dá)量（圖2D）。通過分別比較NTG和轉(zhuǎn)基因小鼠中CGRPβ表達(dá)水平，篩選到在肺和肝臟組織中都高表達(dá)CGRPβ基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

2.3 CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動態(tài)對比分析

于2、4、8和12月齡對NTG和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)行血壓動態(tài)分析。結(jié)果顯示，NTG和轉(zhuǎn)基因陽性小鼠MBP［MBP=舒張壓+1/3（收縮壓-舒張壓）]整體均呈現(xiàn)隨著年齡的增長而逐漸升高的表型。與NTG小鼠（2、4、8和12月齡樣本量分別為n =8，9，8和10）相比，CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠（2、4、8和12月齡樣本量分別為n=7，11，8和14）并未出現(xiàn)明顯的血壓降低，CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠（2、4、8和12月齡樣本量分別為 n=7，12，8和11）在12月齡時MBP顯著降低（P=0.026，圖3）。

3 討論

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管病之一，目前全球高血壓患者約有10億，預(yù)計到2025年，全球的高血壓患者人數(shù)可能會再增加80％［22]。此外，高血壓還是腦卒中、心肌梗死等心血管疾病以及慢性腎臟疾病等最主要的危險因素。高血壓已經(jīng)成為威脅人類生命健康的重要的公共衛(wèi)生問題，其防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Note：A. Establishment of CGRPα transgenic vector；B.Genotyping of CGRPαtransgenic mice by PCR；C.Expression level of CGRPαin the heart，lung，kidney and liver tissues of CGRPα transgenic mice by Western Blot；D.Quantitative analysis of the CGRPαexpression level（n=3 independent experiment）.Fig.1 Establishment of CGRPαtransgenicmice

圖2 CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Note：A. Establishment of CGRPβ transgenic vector；B.Genotyping of CGRPβtransgenic mice by PCR；C.Expression level of CGRPβ in the lung and liver tissues of CGRPβ transgenicmice by Western Blot；D.Quantitative analysis of the CGRPβexpression level（n=3 independent experiment）.Fig.2 Establishment of CGRPβtransgenicmice

外周血管阻力的增大致使慢性高血壓患者的血壓持續(xù)升高［3]，外周阻力調(diào)控系統(tǒng)的功能障礙可能是慢性高血壓的主要病因之一［23]。研究發(fā)現(xiàn)，交感血管收縮神經(jīng)的興奮性增強(qiáng)是外周血管阻力增大的一個重要因素［24]。交感神經(jīng)腎上腺素能神經(jīng)通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)—去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）調(diào)控外周血管阻力，一方面，NE可引起血管極度收縮，外周血管阻力增加，血壓升高；另一方面，NE還可通過激活突觸前α2-腎上腺素能受體抑制CGRP包含神經(jīng)釋放具有血管擴(kuò)張效應(yīng)的CGRP［25]。此外，與NE共定位于外周腎上腺素能神經(jīng)的血管收縮神經(jīng)肽-Y亦可抑制神經(jīng)性的血管擴(kuò)張和CGRP的釋放［26]。CGRP已被證實(shí)是一種強(qiáng)而有效的血管擴(kuò)張神經(jīng)肽［27]。CGRP包含神經(jīng)的功能障礙和CGRP的釋放抑制增強(qiáng)了交感血管收縮神經(jīng)的興奮性，使得血壓進(jìn)一步升高。

圖3 CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠血壓動態(tài)對比分析Note：*P＜0.05.Fig.3 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure in CGRPαand CGRPβtransgenicmice

本文建立了人CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠，并對其進(jìn)行血壓動態(tài)對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NTG小鼠相比，CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠血壓正常，CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠在12月齡時出現(xiàn)平均動脈壓的顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，CGRPα是人甲狀腺髓樣癌的主要降鈣素基因產(chǎn)物，而CGRPβ是人正常組織中的主要CGRP成分［28]；再者，CGRP對阻力血管的調(diào)控效應(yīng)隨著年齡的增長逐漸減弱［4]，外源性的 CGRP能抑制CGRP包含神經(jīng)的血管擴(kuò)張效應(yīng)［29]。這可能是CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠僅在12月齡表現(xiàn)血壓降低的原因。小月齡時，內(nèi)源性CGRP的血管擴(kuò)張效應(yīng)足以維持外周阻力的平衡，外源性CGRP的效應(yīng)被抑制，血壓維持正常水平；隨著年齡的增長，內(nèi)源性CGRP對外周阻力的調(diào)控能力逐漸減弱，此時，外源性CGRP發(fā)揮血管擴(kuò)張功能，CGRP轉(zhuǎn)基因小鼠外周血管阻力減小，血壓下降。此外，有研究報道，CGRPα基因敲除小鼠MBP顯著升高［18]，而本文建立的人CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠在未經(jīng)病理刺激時血壓表現(xiàn)正常，推測，CGRPα轉(zhuǎn)基因小鼠在給予壓力負(fù)荷等病理刺激后，抵抗高血壓的能力會顯著增強(qiáng)。

盡管外周阻力調(diào)控系統(tǒng)中CGRP神經(jīng)的功能抑制對高血壓的維持和發(fā)展至關(guān)重要，但CGRP包含神經(jīng)功能的減弱的潛在機(jī)制仍不清楚。近期研究發(fā)現(xiàn)，SHR 腸系膜動脈中的血管緊張素 II （angiotensin II，Ang II）可通過 Ang II受體抑制CGRP包含神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)［30]，長期抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)可阻止或恢復(fù)CGRP包含神經(jīng)的功能減弱和重構(gòu)［31]。

綜上所述，CGRP與外周血管阻力的調(diào)控密切相關(guān)，本文建立的CGRPα和CGRPβ轉(zhuǎn)基因小鼠為CGRP對外周血管阻力和病理刺激下的高血壓抵抗機(jī)制的研究提供了理想的動物模型。

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Establishment and dynam ic analysis of blood pressure in calcitonin gene-related peptide transgenic m ice

BAO Dan，DONGWei，ZHANG Xu，LIU Ning，GAO Shan，ZAHNG Hai-tao，GAO Xiang，GEWen-ping，LV Dan
（Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences Comparative Medicine Center，Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Peaking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective To establish calcitonin gene-related peptideα（CGRPα）andβ（CGRPβ）transgenicmice and analyze dynamic changes of blood pressure using this transgenic mouse model in hypertension research.M ethods The transgenic vector was constructed by inserting the human CGRPαand CGRPβgene into the down steam of chickenβactin promoter，respectively.The transgenic mice were created by microinjection.The genotype of transgenic line was identified by PCR and the expression level of target gene was determined by Western blot.Dynamic changes of blood pressure wasmeasured by noninvasive blood pressure meter.Resu lts One line of human CGRPαC57BL/6J transgenic mice with high levels of CGRPαexpression in the heart，lung，kidney and liver tissueswas established.One line of human CGRPβC57BL/6J transgenic mice with high levels of CGRPβexpression in the lung and liver tissues was established.Mice overexpressing the human CGRPαwere normotensive，whereas mice overexpressing the human CGRPβwere hypotensive at12 months ofage.Conclusions CGRPαand CGRPβtransgenicmicemay serve as an animalmodel for themechanism research on the roles of CGRP on peripheral vascular resistance and hypertension resistance.

CGRP；Transgene；Peripheral vascular resistance；Hypertension resistance

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0011-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.003

國家自然科學(xué)基金（31301932）。

鮑丹（1987-），女，本科，心肌病和高血壓動物模型的制備與分析。

呂丹（1980-），女，副研究員，心肌病及高血壓相關(guān)動物模型建立及相關(guān)調(diào)節(jié)基因功能分析。

﹞2015-08-18

研究報告