丁慧美,阮 華,黃紅輝

（淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

斑馬魚(yú)uba6和uba7突變體的構(gòu)建與鑒定

丁慧美,阮 華,黃紅輝

（淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

目的 構(gòu)建斑馬魚(yú)uba6和uba7突變體。方法 運(yùn)用TALEN技術(shù)在斑馬魚(yú)uba6和uba7基因編碼區(qū)引進(jìn)突變，并測(cè)序鑒定突變類型。結(jié)果 成功獲得了兩種突變類型的uba6和三種突變類型的uba7斑馬魚(yú)突變體。結(jié)論 成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)uba6和uba7突變體，為進(jìn)一步研究斑馬魚(yú)uba6和uba7基因的功能提供了材料。

斑馬魚(yú)；uba6基因；uba7基因；TALEN

TALEN （transcription activator-like （TAL）effector nucleases）是一種新型的靶向基因編輯技術(shù)，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、植物、斑馬魚(yú)及大、小鼠等各類研究對(duì)象。其原理是利用植物細(xì)菌Xanthomonas sp.TALE蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列可對(duì)應(yīng)識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的核酸，組裝Xanthomonas sp.TALE的氨基酸序列模塊識(shí)別特定DNA序列，并與核酸酶重組融合，這一人工構(gòu)建的核酸酶可在特定位點(diǎn)識(shí)別（通過(guò)TALE氨基酸序列模塊執(zhí)行）并剪切（通過(guò)核酸酶執(zhí)行）目的基因DNA序列，斷裂的DNA在修復(fù)過(guò)程中會(huì)引進(jìn)小片段插入或缺失，導(dǎo)致基因突變［7-8]。

斑馬魚(yú)是研究脊椎動(dòng)物發(fā)育的理想模式動(dòng)物，其基因組與人類高度同源。小鼠中UBA6和UBA7基因功能已有一定的研究［4，6]，但在斑馬魚(yú)中這兩個(gè)基因的功能尚不可知，運(yùn)用反向遺傳學(xué)手段在斑馬魚(yú)中建立突變體有助于研究其功能。本文應(yīng)用TALEN技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)中uba6和uba7基因進(jìn)行編輯，通過(guò)篩選獲得可遺傳的突變體，為后續(xù)進(jìn)一步探究斑馬魚(yú)中uba6和uba7基因的功能提供了重要材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚(yú)品系A(chǔ)B Tüebingen品系。

1.1.2 質(zhì)粒

另外，教師在實(shí)踐中要引導(dǎo)學(xué)生自己摸索實(shí)驗(yàn)條件，想辦法改進(jìn)操作方法。例如，某小組探究“綠色蔬菜變黃過(guò)程中色素的變化”，預(yù)計(jì)提取、分離新鮮和放置變黃后的菠菜葉中的色素進(jìn)行比較，但時(shí)值5月，菠菜放在冰箱，沒(méi)變太黃前就腐爛了，教師要引導(dǎo)學(xué)生分析原因，摸索儲(chǔ)存條件，或探尋其他的實(shí)驗(yàn)方法。某小組探究“紅花檵木紫色葉片中的色素種類”設(shè)計(jì)了用清水紙層析分離色素的實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，濾紙條吸水后變軟變重，會(huì)貼壁或倒入水中。因此，不能像平時(shí)實(shí)驗(yàn)中那樣把濾紙條靠在試管或小燒杯壁上，學(xué)生自主進(jìn)行了改進(jìn)：使用試管架和夾子把濾紙條固定并吊在液面上方，保證下端沒(méi)入水中而不會(huì)整根濾紙條倒入水中。

TALEN載體為pCS2-FokⅠ，靶向uba6基因外顯子5和uba7基因外顯子2的TALEN質(zhì)粒由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。uba6靶位點(diǎn)：CTGGGCACCAACTTCT tcatcagagaggagg ATGTGAATA ATCAGA，其中左臂 TALE識(shí)別序列 CTGGGCA CCAACTTCT 16 bp，右臂TALE識(shí)別序列TCTGATT ATTCACAT 15 bp，間隔15 bp，突變體檢測(cè)酶BseRI識(shí)別序列 GAGGAG。uba7靶位點(diǎn)：TGCCAAAAA CGTGATcctggctggagttagaACAGTTACAATTCAGG，其中左臂TALE識(shí)別序列TGCCAAAAA CGTGAT 15 bp，右臂TALE識(shí)別序列CCTGAATTGTAACTGT 16 bp，間隔16 bp，突變體檢測(cè)酶Bpm I識(shí)別序列CTGGAG。

1.1.3 引物

uba6基因外顯子5擴(kuò)增引物：TTGCTGATATAG GTGACTTGGAG（正向），CACATTAACCTTTCAC CGGAAG（反向）；uba7基因外顯子2擴(kuò)增引物：GGTAATTATTTTGGCACCAACAGC（正向），GGAGT TACAAATGCCTATGTGCC（反向）。

1.1.4 主要試劑

本文實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物技術(shù)公司以及上海Invitrogen公司合成。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；AxyPrepTM plasimid Miniprep Kit和AxyPrepTM PCRCleanup Kit購(gòu)自 Axygen公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Roche公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Ambion公司。

1.2 方法

1.2.1 胚胎收集

在成年斑馬魚(yú)交配前一天將斑馬魚(yú)置于有適量養(yǎng)殖系統(tǒng)水的交配盒中，用擋板將雌雄斑馬魚(yú)分開(kāi)。次日早晨，將擋板拔出，斑馬魚(yú)產(chǎn)卵，30 min后可收集，放置于28℃恒溫培養(yǎng)，在胚胎12 hpf（hour post-fertilization）時(shí)加入0.03％PTU抑制色素形成。

1.2.2 全胚胎原位雜交

探針合成與全胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)依據(jù)已有報(bào)導(dǎo)進(jìn)行［9]。本實(shí)驗(yàn)中所用uba6和uba7RNA反義探針濃度為1 ug/mL。

1.2.3 斑馬魚(yú)uba6和uba7突變體的構(gòu)建

將體外轉(zhuǎn)錄的編碼識(shí)別TALE左右臂序列蛋白和核酸酶融合蛋白的mRNA等量混合顯微注射入一細(xì)胞期斑馬魚(yú)胚胎，注射濃度為500 pg/nL。在1.5 dpf（day post-fertilization）收集胚胎至EP管中，每管8個(gè)胚胎，加入80 uL 50 mmol/L NaOH溶液，95℃加熱裂解10 min，冷卻后加入 8 uL 1mol/L Tris8.0混合均勻，即為提取的基因組DNA。以此基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用特定的酶進(jìn)行酶切檢測(cè)。如果對(duì)照組胚胎的PCR產(chǎn)物能夠全部被切開(kāi)，而注射過(guò)mRNA的實(shí)驗(yàn)組胚胎的PCR產(chǎn)物中有未切開(kāi)的PCR條帶，則說(shuō)明靶點(diǎn)發(fā)生了突變，TALEN質(zhì)粒有效。將注射后的斑馬魚(yú)胚胎飼養(yǎng)至成魚(yú)，為F0代。F0代與野生型交配產(chǎn)卵，收集胚胎，重復(fù)上述步驟提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增及酶切檢測(cè)，確定此F0是否在生殖細(xì)胞水平攜帶突變，如攜帶突變，將F0與野生型生產(chǎn)的胚胎飼養(yǎng)至成魚(yú)，為F1代。拔取F1成魚(yú)鱗片，將魚(yú)鱗片放入PCR管中，加入10 uL 50 mmol/L NaOH溶液，95℃加熱裂解 10 min，冷卻后加入 8 uL 1mol/L Tris8.0混合均勻，獲得基因組DNA。以此基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送樣測(cè)序，通過(guò)讀取套峰獲得斑馬魚(yú)F1突變類型。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)uba6基因的時(shí)空表達(dá)模式

檢測(cè)基因時(shí)空表達(dá)模式有助于研究基因的功能。我們運(yùn)用全胚胎原位雜交的方法檢測(cè)了斑馬魚(yú)中uba6基因早期的表達(dá)模式。結(jié)果顯示uba6呈現(xiàn)全身性表達(dá)，在1～3 dpf時(shí)于腸中有一定程度的富集，此富集隨發(fā)育的進(jìn)行趨于明顯（彩插3圖1）。

2.2 斑馬魚(yú)uba7基因的時(shí)空表達(dá)模式

類似于uba6基因，我們也檢測(cè)了uba7基因的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果顯示，uba7基因在1～3 dpf的斑馬魚(yú)胚胎中表達(dá)，表達(dá)模式為全身性，在腸中稍有富集（彩插3圖2）。

2.3 斑馬魚(yú)中uba6和uba7突變體建立

2.3.1 TALEN質(zhì)粒活性檢測(cè)

為檢測(cè)TALEN靶點(diǎn)設(shè)計(jì)是否工作，必須檢測(cè)質(zhì)粒的活性。將以質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄的mRNA注射至一細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中，提取注射后胚胎的基因組DNA，PCR擴(kuò)增包含靶點(diǎn)的DNA片段，酶切檢測(cè)此片段能否被切開(kāi)。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組野生型胚胎的PCR產(chǎn)物能夠完全被切開(kāi)；而實(shí)驗(yàn)組即注射了mRNA的斑馬魚(yú)胚胎中部分PCR產(chǎn)物被切開(kāi)，部分PCR產(chǎn)物未被切開(kāi)，說(shuō)明該靶點(diǎn)發(fā)生了突變，且效率較高。

2.3.2 F0突變體篩選

將上述實(shí)驗(yàn)中注射mRNA的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)至成魚(yú)，為F0代。F0是野生型和突變型細(xì)胞的嵌合體，為檢測(cè)突變是否產(chǎn)生在生殖細(xì)胞水平，將F0代與野生型交配產(chǎn)生F1子代，提取F1胚胎的基因組DNA，采取2.3.1中相同的策略，即PCR擴(kuò)增含靶位點(diǎn)的基因組DNA并酶切檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組野生型的PCR產(chǎn)物能夠完全被切開(kāi)；而實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物未能被全部切開(kāi)，這說(shuō)明部分F1子代含有靶位點(diǎn)突變，F(xiàn)0代含有可遺傳的突變，將F1代斑馬魚(yú)胚胎飼養(yǎng)至成魚(yú)。

圖3 TALEN質(zhì)?；钚詸z測(cè)及F0篩選Note：asterisk，PCR product；arrowhead，enzyme digest products.Fig.3 Activity tests of TALEN plasmids and F0 screen

2.3.3 F1突變體篩選

F1代斑馬魚(yú)中含有野生型和雜合突變體，為鑒定出雜合突變體，拔取少許F1成魚(yú)鱗片，提取基因組DNA，擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)的基因組DNA片段，測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)序列，測(cè)序結(jié)果顯示F1代含有多種突變類型，表1和表2分別列舉了F1代中篩選獲得的移碼突變類型，其中紅色標(biāo)記部分是TALEN設(shè)計(jì)敲除的靶位點(diǎn)序列，這些移碼突變都可以產(chǎn)生早熟終止密碼子。

表1 TALEN uba6 F1突變類型Tab.1 TALEN uba6 F1 mutation type

表2 TALEN uba7 F1突變類型Tab.2 TALEN uba7 F1 mutation type

3 討論

小鼠中的研究表明，UBA6基因敲除會(huì)導(dǎo)致突變體胚胎在E10.5死亡［4]，而UBA7基因的敲除雖然不影響小鼠的存活與生殖，但是會(huì)導(dǎo)致ISG15蛋白修飾的缺失［6]。斑馬魚(yú)中這兩個(gè)基因的功能未有報(bào)道，我們構(gòu)建的uba6和uba7突變體將是在斑馬魚(yú)中研究其功能的出發(fā)材料?；虻臅r(shí)空表達(dá)模式結(jié)果顯示，兩個(gè)基因在胚胎期都有表達(dá)，這提示著兩個(gè)基因有可能調(diào)控斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育。盡管我們獲得的突變體中基因突變會(huì)導(dǎo)致移碼，但是它們有可能不會(huì)導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)發(fā)育缺陷表型，可能的原因有以下幾種（1）斑馬魚(yú)中有其他基因（例如可能存在的復(fù)制基因、功能相似的基因等）補(bǔ)償了突變基因的功能；（2）斑馬魚(yú)uba6和uba7基因有可能存在多種異構(gòu)體，突變并沒(méi)有導(dǎo)致所以異構(gòu)體移碼突變；（3）兩者不是斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育必需的基因。

運(yùn)用TALEN技術(shù)構(gòu)建突變體，可以獲得多種突變類型，通常都是小片段DNA的插入或缺失。我們的實(shí)驗(yàn)中也獲得了多種突變類型，只保留了引起移碼的突變，這些突變都導(dǎo)致了早熟終止密碼子的出現(xiàn)，從理論上分析這些突變可以導(dǎo)致基因功能喪失，但是還是需要其他分子生物學(xué)方法的驗(yàn)證。

［1] Hershko A，Ciechanover A.The ubiquitin system［J].Annu Rev Biochem.1998，67：425-479.

［2] Pelzer C，Kassner I，Matentzoglu K，etal.UBE1L2，a novel E1 enzyme specific for ubiquitin［J].J Biol Chem.2007，282 （32）：23010-23014.

［3] Jin J，Li X，Gygi SP，et al.Dual E1 activation systems for ubiquitin differentially regulate E2 enzyme charging ［J].Nature.2007，447（7148）：1135-1138.

［4] Chiu YH，Sun Q，Chen ZJ.E1-L2 activates both ubiquitin and FAT10［J].Mol Cell.2007，27（6）：1014-1023.

［5] Yuan W，Krug RM.Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon（IFN）-induced ubiquitin-like ISG15 protein［J].EMBO J.2001，20（3）：362-371.

［6] Kim KI，Yan M，Malakhova O，et al.Ube1L and protein ISGylation are not essential for alpha/beta interferon signaling［J].Mol Cell Biol.2006，26（2）：472-479.

［7] Miller JC，Tan S，Qiao G，et al.A TALE nuclease architecture for efficientgenome editing［J].Nat Biotechnol.2011，29：143–148.

［8] ZhongweiQiu，Meizhen Liu， Zhaohua Chen， et al. Highefficiency and heritable gene targeting in mouse by transcription activator-like effector nucleases［J].Nucleic Acids Res.2013，41（11）：e120.

［9] Huang H，Ruan H，Aw M Y，et al.Mypt1-mediated spatial positioning of Bmp2-producing cells is essential for liver organogenesis［J].Development.2008，135（19）：3209 -3218.

Construction and identification of zebrafish uba6 and uba7 mutants by TALEN

DING Hui-mei，RUAN Hua，HUANG Hong-hui
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development，Ministry of Education，State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environments and Bio-Resources of the Three Gorges Reservoir Region，School of Life Sciences，Southwest University，Beibei，Chongqing 400715，China）

Objective To construct zebrafish uba6 and uba7mutants.Method In-delswere introduced into coding regions of zebrafish uba6 and uba7 gene by TALEN technology，andmutation typeswere identified by sequencing.Results We obtained two uba6 and three uba7mutantswith different small fragment deletions resulting in reading frame shifts.Conclusion These uba6 and uba7mutants provided startingmaterials for the study of zebrafish uba6 and uba7 gene functions.

Zebrafish；uba6；uba7；TALEN

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0007-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.002

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071286）；西南大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（XDJK2014A013；2362014xk02）。

丁慧美（1990-），女，碩士，研究方向：發(fā)育生物學(xué)E-mail：15895840307@163.com。

黃紅輝（1974-），男，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學(xué)E-mail：honghuih@126.com；阮華（1974-），女，博士，教授，研究方向：發(fā)育生物學(xué)，E-mail：ruanhua23@126.com。

﹞2015-08-18

研究報(bào)告