樊璐

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，流行病學(xué)調(diào)查顯示人群中乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%[1]，其中江西地區(qū)13.12%[2]。乙型肝炎病毒(HBV)是重要的輸血傳播病原體之一，對(duì)輸血安全構(gòu)成威脅，主要表現(xiàn)在窗口期感染和隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)。 在排除窗口期感染情況下，個(gè)體在肝臟或血液中存在HBV DNA，常規(guī)血清學(xué)方法檢測(cè)為HBsAg陰性，而在核酸水平檢測(cè)HBV DNA陽性的感染稱為OBI[3]。目前我國采供血系統(tǒng)采用酶聯(lián)免疫方法(EIA)對(duì)HBV感染后的血清學(xué)標(biāo)志物HBsAg進(jìn)行輸血前篩查，隨著酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑質(zhì)量的不斷提升，輸血傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)已大大降低[4]。因HBsAg檢測(cè)存在窗口期問題、HBV感染的非典型血清轉(zhuǎn)陽情況以及病毒變異等引起的隱匿性感染，僅通過檢測(cè)HBsAg篩查HBV仍存在一定比例漏檢[5,6]。核酸擴(kuò)增檢測(cè)(nucleic acid amplification test，NAT)是通過擴(kuò)增檢測(cè)病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱，與血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，NAT能縮短HBsAg血清轉(zhuǎn)換前檢測(cè)的窗口期及提高OBI檢出[7,8]，有效加強(qiáng)血液安全。國家衛(wèi)計(jì)委從2010年開始在國內(nèi)部分省市血液中心開展NAT試點(diǎn)工作，在降低血液病毒窗口期、OBI等輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)[9]方面取得顯著成績(jī)。我中心作為試點(diǎn)單位之一，將ELISA與NAT作為重要的互補(bǔ)手段應(yīng)用于獻(xiàn)血者常規(guī)篩查，并對(duì)部分HBsAg-/HBV DNA+血液進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物(HBV-M)檢測(cè)分析，評(píng)估南昌地區(qū)獻(xiàn)血者OBI傳播風(fēng)險(xiǎn)，為完善采供血系統(tǒng)HBV血液篩查模式提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本中心2010年8月至2014年12月經(jīng)健康征詢及快速HBsAg金標(biāo)試紙篩查合格的無償獻(xiàn)血者共計(jì)297146人次，其中男性183958人次，女性113188人次，年齡18～55周歲，均符合國家《獻(xiàn)血者健康檢查要求》。使用EDTA-K2抗凝負(fù)壓真空管留取獻(xiàn)血者等量靜脈血2管(無分離膠的用于EIA檢測(cè)，有分離膠的用于NAT檢測(cè))，各5ml，標(biāo)本離心和保存均按相應(yīng)的檢測(cè)試劑說明書要求操作。

1.2 儀器 STAR全自動(dòng)加樣儀(瑞士HAMILTON公司)；FAME全自動(dòng)酶免分析儀 (瑞士HAMILTON公司)；羅氏Cobas S201核酸檢測(cè)系統(tǒng)：Microlab STAR IVD混樣儀 (瑞士 HAMILTON公司)；Cobas AmpliPrep核酸提取儀(美國Roche公司)；Cobas TaqMan擴(kuò)增儀(美國Roche公司)；Cobas e411電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國Roche公司)。儀器均每年定期校驗(yàn)。

1.3 試劑 HBsAg初篩金標(biāo)試劑：廈門英科新創(chuàng)；HBsAg ELISA試劑：廈門英科新創(chuàng)(初檢)、北京金豪 (復(fù)檢)；HBV/HCV/HIV核酸聯(lián)檢試劑：美國Roche公司Cobas Taqscreen MPX Test1.0(定性檢測(cè))；HBV-M試劑：美國Roche公司Cobas e411系統(tǒng)配套試劑(電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定)。試劑均批批檢合格并在有效期內(nèi)使用。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 HBsAg檢測(cè) (1)獻(xiàn)血前檢查：無償獻(xiàn)血者指端末梢靜脈血標(biāo)本經(jīng)HBsAg膠體金法試紙初篩為陰性；(2)血液篩查：采用ELISA法對(duì)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg雙試劑初復(fù)檢，每種試劑均嚴(yán)格依據(jù)試劑說明書設(shè)定臨界值(Cutoff值)及灰區(qū)，OD<(80%×Cutoff)判定為無反應(yīng)性，OD≥(80%×Cutoff)判為有反應(yīng)性。初檢及復(fù)檢均為無反應(yīng)性，標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果判為陰性；初次反應(yīng)性標(biāo)本按本中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行雙孔重復(fù)檢測(cè)，兩孔均為無反應(yīng)性時(shí)判為陰性，一孔或兩孔呈反應(yīng)性時(shí)判為陽性。

1.4.2 HBV DNA檢測(cè) 采用核酸檢測(cè)(NAT)方法對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg陰性的血液標(biāo)本進(jìn)行6混樣模式HBV/HCV/HIV聯(lián)合核酸定性檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)有反應(yīng)性的混合標(biāo)本進(jìn)行拆分。單人份標(biāo)本檢測(cè)陽性判定為NAT陽性，單人份標(biāo)本檢測(cè)陰性判定為NAT陰性。

1.4.3 NAT陽性標(biāo)本的確證 將拆分單人份檢測(cè)為NAT陽性的標(biāo)本送國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心，使用羅氏病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行HBV DNA鑒別確證試驗(yàn)(熒光定量PCR法)。

1.4.4 HBV-M檢測(cè) 將HBV DNA鑒別確證試驗(yàn)陽性血液標(biāo)本采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)。所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.5 數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Microsoft Excel軟件對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg陽性和NAT檢測(cè)HBV DNA陽性標(biāo)本的結(jié)果進(jìn)行匯總和分類統(tǒng)計(jì)；對(duì)HBV-M檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行各種模式構(gòu)成比的比較。使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)297146份經(jīng)HBsAg快速金標(biāo)法篩查合格的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)血清學(xué)雙試劑酶免檢測(cè)，ELISA法共檢出HBsAg陽性標(biāo)本4965例，陽性率為1.67%，結(jié)果見表1；對(duì)292181份HBsAg篩查陰性標(biāo)本進(jìn)行HBV/HCV/HIV聯(lián)合核酸檢測(cè)，共檢出NAT陽性標(biāo)本531例，其中最終經(jīng)鑒別確證為HBV DNA陽性的標(biāo)本311例，陽性率為0.11%，結(jié)果見表 2；對(duì) 311例HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者標(biāo)本采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)，共有10種模式，各種模式陽性率詳見表3；對(duì)其中5名獻(xiàn)血者進(jìn)行獻(xiàn)血后隨訪，有1名獻(xiàn)血者HBeAb由陰性轉(zhuǎn)化為陽性，其余HBV血清學(xué)模式無改變，結(jié)果見表4。

表1 HBsAg ELISA檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

表2 HBV DNA檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

表3 HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者HBV血清標(biāo)志物模式

表4 5名HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者隨訪檢測(cè)結(jié)果

3 討論

HBV感染是危害人類健康最嚴(yán)重的問題之一，全球約有3.5億人是HBV慢性感染攜帶者[10]，中國有超過9300萬人感染或攜帶HBV。HBV可經(jīng)輸血傳播，并且與病毒本身、檢測(cè)手段等因素關(guān)系密切。輸血引起的病毒感染主要是HBV感染[11]，有研究表明，HBV血清轉(zhuǎn)換前窗口期與隱匿性感染獻(xiàn)血者是導(dǎo)致HBsAg篩查后經(jīng)輸血傳播HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)的主要原因[12]。HBV感染后最早存在于血清中是HBV DNA，實(shí)行HBV DNA檢測(cè)可以明顯縮短窗口期，篩查出隱匿性感染或HBV慢性攜帶者[13]。 據(jù) Satake M 等人報(bào)道[14]，2%～18%的 HB-sAg陰性患者經(jīng)輸注HBV DNA陽性血液后導(dǎo)致HBV感染，并且隱匿性感染者(HBcAb陽性)供血引起的輸血后感染風(fēng)險(xiǎn)是窗口期供血的10倍以上，因此OBI更應(yīng)引起高度重視。

HBsAg檢測(cè)靈敏度受病毒基因型、變異情況、獻(xiàn)血者體內(nèi)是否存在HBsAb以及是否聯(lián)合其它疾病感染等多重因素影響[15]。目前的HBsAg診斷試劑對(duì)于不同突變的HBsAg檢測(cè)能力不同，甚至發(fā)生漏檢，導(dǎo)致出現(xiàn)HBsAg-/HBV DNA+的情況。HBV核酸篩查的開展為隱匿性HBV的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。OBI流行于世界各地區(qū)，其感染率與HBV流行率呈正相關(guān)[16]。我國無償獻(xiàn)血者中的OBI流行率為1:570-1:7517[17-19]。目前國內(nèi)數(shù)家血液中心已對(duì)無償獻(xiàn)血人群血液標(biāo)本進(jìn)行EIA/NAT檢測(cè)，篩選OBI確診標(biāo)本，其中深圳地區(qū)OBI流行率約為0.33%[20]，唐山地區(qū)約為0.29%[21]，江蘇地區(qū)約為0.80%[22]，大連地區(qū)約為0.43%[23]，我中心劉強(qiáng)等人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)南昌地區(qū)約為1.38%[24]。各地區(qū)感染率的差異可能與各地獻(xiàn)血人群構(gòu)成不同及HBV感染情況不一相關(guān)。

隨著核酸檢測(cè)不斷深入開展，發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)酶免方法進(jìn)行血液篩查，輸血傳播HBV的殘余風(fēng)險(xiǎn)明顯高于HCV和HIV。本中心于2010年起在原有EIA檢測(cè)基礎(chǔ)上增加NAT，運(yùn)用羅氏Cobas S201平臺(tái)對(duì)ELISA陰性血液標(biāo)本進(jìn)行6人份混樣NAT，篩查 HBV DNA，HCV RNA 及 HIV RNA。 隨著高靈敏度的自動(dòng)化核酸檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用于血液篩查，HBV核酸檢出能力有了大幅度提高。自2010年8月至2014年12月對(duì)292181份HBsAg篩查陰性獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)，檢出311例HBsAg-/HBV DNA+樣本，陽性率為0.11%，此數(shù)據(jù)充分表明本地區(qū)HBsAg陰性獻(xiàn)血者血液仍有一定的經(jīng)輸血傳播HBV殘留風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果顯示，血液病毒核酸檢測(cè)能有效篩檢出HBsAg為無反應(yīng)性的HBV感染標(biāo)本，對(duì)于避免OBI或HBV窗口期等輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要，是保障血液安全的一項(xiàng)有效措施。本研究中HBsAg陰性樣本HBV DNA陽性率高于國外HBV低流行率國家的檢出率，也高于國內(nèi)一些省份的檢出率[25]，其主要原因可能是江西地區(qū)為HBV高流行區(qū)所致。本研究發(fā)現(xiàn)男性獻(xiàn)血者中HBsAg陽性率、HBV DNA陽性率均高于女性，這可能與南昌地區(qū)普通人群中HBV的流行特征有關(guān)。18~25歲獻(xiàn)血者中的HBV檢測(cè)陽性率明顯低于25~55歲獻(xiàn)血者，我國于1991年開始普及新生兒接種乙肝疫苗，18~25歲年齡組處于疫苗保護(hù)作用中，故HBV陽性率最低，驗(yàn)證了年齡與陽性率的關(guān)系。初次獻(xiàn)血人群中HBsAg及HBV DNA陽性率均顯著高于重復(fù)獻(xiàn)血人群，表明初次獻(xiàn)血者HBV感染率高于重復(fù)獻(xiàn)血者。

HBV血清學(xué)特征復(fù)雜多變，感染者會(huì)在不同時(shí)期出現(xiàn)不同的血清標(biāo)志物。WHO推薦的HBV篩查策略為：HBsAg、HBcAb(適合情況下)和病毒核酸檢測(cè)HBV DNA[26]。HBV窗口期與隱匿性感染獻(xiàn)血者均為血清HBsAg陰性而HBV DNA陽性；窗口期獻(xiàn)血者HBsAg會(huì)隨時(shí)間推移由陰轉(zhuǎn)陽，而OBI獻(xiàn)血者其HBsAg一般不會(huì)陽轉(zhuǎn)，并通常伴隨HBcAb陽性，有時(shí)在低滴度HBsAb獻(xiàn)血者中也存在[27,28]。由于HBsAg陰性、HBcAb陽性人群如OBI個(gè)體捐獻(xiàn)的血液有輸血傳播HBV的可能性，一些發(fā)達(dá)國家開展了HBV感染后的另一重要血清學(xué)標(biāo)志物核心抗體(HBcAb)篩查。由于HBcAb篩查容易導(dǎo)致血源浪費(fèi)，僅適合乙肝低流行率區(qū)域[12]。在乙肝高發(fā)地區(qū)，因其抗-HBc陽性率較高，在獻(xiàn)血者中不能普遍開展該項(xiàng)目檢測(cè)，則開展NAT以進(jìn)一步降低輸血傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)十分必要。本研究發(fā)現(xiàn)的311例HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本經(jīng)乙肝補(bǔ)充血清學(xué)試驗(yàn)，表現(xiàn)為10種血清學(xué)模式，其中HBVM全部陰性占9.65%，疑似窗口期感染；HBsAg陽性占23.15%，表明ELISA試劑靈敏度有待提高；HBcAb陽 性 占 87.78%，HBcAb、HBeAb 陽 性 占55.62%，HBsAb、HBcAb 陽 性 占 24.76% ，HBsAb、HBeAb、HBcAb陽 性 占 10.61%。 HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者中HBcAb陽性比例最大，這符合OBI的表現(xiàn)形式[29],表明本地區(qū)OBI獻(xiàn)血者的血清學(xué)特征以HBcAb陽性為主。HBcAb陽性時(shí)可能處于乙肝慢性感染期或恢復(fù)期，因HBV復(fù)制水平低，HB-sAg濃度未達(dá)到試劑敏感度，低于最低檢測(cè)限，多數(shù)為隱匿感染所致。此現(xiàn)象的發(fā)生也可能是高濃度HBsAg導(dǎo)致后帶現(xiàn)象，出現(xiàn)假低值，嚴(yán)重時(shí)可以造成假陰性[30]。對(duì)5位HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者進(jìn)行隨訪，結(jié)果一直為HBsAg陰性、HBcAb陽性，表明隱匿性HBV感染可能性較高。

近年來在國家衛(wèi)計(jì)委的推動(dòng)下，血液篩查策略由 2遍ELISA檢測(cè)向 1遍 ELISA檢測(cè)、1遍NAT檢測(cè)過渡，可盡量減少隱匿性HBV感染等因素引發(fā)的輸血安全問題，對(duì)于保障血液質(zhì)量具有重要意義。針對(duì)隱匿性HBV感染的特點(diǎn)，采供血系統(tǒng)應(yīng)選用靈敏度和特異性較高的酶免檢測(cè)試劑，適當(dāng)聯(lián)合使用國外優(yōu)質(zhì)試劑，并進(jìn)一步開展HBV核酸定性及定量檢測(cè)，普及白細(xì)胞過濾及病毒滅活等減少血液制品輸血相關(guān)病毒感染的處理方法。在HBV高流行區(qū)，要高度關(guān)注獻(xiàn)血者HBV血清標(biāo)志物，條件允許的情況下，盡可能增加篩查指標(biāo)。核酸檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用是采供血系統(tǒng)血液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室預(yù)防漏檢的主要途徑，防控HBV感染捐獻(xiàn)者尤其是隱匿性或窗口期感染者是降低輸血風(fēng)險(xiǎn)的根本。

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