田耘博，黃霞，秦偉斐，李維，毛偉，廖紅文，段恒英，何濤

(重慶市血液中心，重慶 400015)

獻(xiàn)血樣本的病毒核酸檢測 （nucleic acid testing，NAT）可有效地降低輸血相關(guān)傳染病病毒的傳播風(fēng)險，在采供血機(jī)構(gòu)正廣泛普及[1]。運(yùn)用NAT不僅能檢測出很多在酶聯(lián)免疫吸附檢測 （enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA）窗口期（window period，WP） 的乙型肝炎病毒 （HBV）、 艾滋病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染，還能避免因病毒變異，免疫靜默性感染等導(dǎo)致的常規(guī)ELISA的漏檢[2]。對于體現(xiàn)NAT優(yōu)勢的NAT單獨(dú)陽性獻(xiàn)血樣本，其真正的陽性率和不同NAT檢測系統(tǒng)結(jié)果的差異，我們進(jìn)行了一些研究和探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 重慶市血液中心2011年3月-12月經(jīng)體檢和血液快檢合格的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本47004例。分別用含分離膠的 “非可替”抗凝真空NAT專用采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集6~8 ml全血用于NAT檢測；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集4~5ml全血用于ELISA檢測。采集后的標(biāo)本管置于4℃保存，在采集4~6h內(nèi)1800g離心10min，檢測前置于4℃保存。

1.2 主要儀器 RSP150/200型全自動加樣儀 （瑞士TECA公司）和FAME 2420/30全自動酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司）、Procleix TIGRIS全自動核酸檢測分析系統(tǒng) （美國諾華公司）及配套的PRI(試劑準(zhǔn)備溫育器，美國Chiron公司)、MAGCOR核酸全自動提取儀（臺灣MAGCORE公司）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、RT3100洗板機(jī)（深圳雷杜公司）、EXL808酶標(biāo)儀 （美國BIO-TEK公司）、L535R離心機(jī)（湖南湘儀公司）。

1.3 主要試劑 ⑴ELISA檢測試劑：HBsAg為乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒 （北京萬泰，批號：350277、350279；法國生物梅里埃，批號： BM4732、BM3328）、丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒（上?？迫A，批號：201105432、201105443；美國強(qiáng)生，批號：GH5809、GH5897）、HIV（1+2）P24 抗原及抗體診斷試劑盒 （法國生物梅里埃，批號：BV32876、HG33287）、HIV抗體診斷試劑盒（上?？迫A，批號：201101234、201103213）。⑵核酸檢測試劑：Procleix Ultro核酸檢測試劑盒 （美國諾華公司，批號：613254），該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA和HBV DNA，試劑盒內(nèi)含有配套的Procleix HIV-1/HBV/HCV鑒別試劑；血液核酸篩查試劑盒 （上海科華公司，批號：20119325）。⑶乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測試劑和HB-sAg中和確證試劑：乙型肝炎診斷試劑盒（HBsAb、HBeAg、HBeAb 和 HBcAb）（上 海 科 華 ， 批 號 ：201103025、201102016、201105109、20110615）、Hepanostika HBsAg Ultra Confirmatory中和確證試劑盒（法國生物梅里埃，批號：B12NA）。

1.4 檢測過程

1.4.1 ELISA 對47004例無償獻(xiàn)血標(biāo)本的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及HIV P24Ag用2種ELISA試劑在FAME 2420/30上平行檢測，相關(guān)的操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書和儀器說明書進(jìn)行。當(dāng)標(biāo)本OD值/Cut off值（S/CO值）≥0.8判為反應(yīng)性，標(biāo)本S/CO值<0.8時，判定為無反應(yīng)性。2種試劑均為反應(yīng)性判定為ELISA檢測陽性，均為無反應(yīng)性判定為ELISA陰性；單試劑反應(yīng)性用同一試劑做雙孔復(fù)試，雙孔復(fù)試中有1孔及以上為反應(yīng)性則判定為ELISA檢測陽性，雙孔復(fù)試均為無反應(yīng)性判定為ELISA陰性。

1.4.2 NAT所有標(biāo)本均采用單人份檢測。⑴TMA檢測：對47007例獻(xiàn)血標(biāo)本進(jìn)行ELISA的同時，進(jìn)行 NAT。 用諾華 Procleix Ultro Assay的 HIV-1、HBV和HCV三項聯(lián)合核酸檢測試劑，基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) 的 擴(kuò) 增 （transcription mediated amplification，TMA）技術(shù)在Procleix TIGRIS上進(jìn)行檢測。對聯(lián)檢反應(yīng)性的標(biāo)本，再用Procleix HIV-1/HBV/HCV Discriminatory Assay鑒別試劑在同一臺儀器上進(jìn)行鑒別檢測，以確定具體的感染病毒類型。⑵交替NAT：對TMA試劑聯(lián)檢陽性而ELISA檢測陰性的標(biāo)本，采用科華血液核酸篩查試劑盒利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)進(jìn)行交替NAT，MAGCORE全自動核酸提取系統(tǒng)進(jìn)行核酸提取，用科華的血液核酸篩查試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測，所有操作均按相應(yīng)的儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 乙肝兩對半檢測和HBsAg中和確證檢測 對NAT聯(lián)檢陽性的標(biāo)本用科華乙型肝炎診斷試劑盒，采用手工法在洗板機(jī)和酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測。按相應(yīng)的儀器和試劑盒說明操作，由酶標(biāo)儀配套軟件判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)標(biāo)本S/CO值≥1判為陽性，標(biāo)本S/CO值<1時，判定為陰性。選取余量足夠，狀態(tài)較好的部分剩余標(biāo)本，做HBsAg中和確證檢測，按相應(yīng)的儀器和試劑盒說明書操作，由HBsAg確證試劑說明書的方法計算并判定結(jié)果。

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 將NAT、ELISA、乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測和HBsAg中和確證檢測的結(jié)果數(shù)據(jù)輸入電腦，采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行匯總和分類統(tǒng)計，對2種NAT檢測方法的結(jié)果和乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測的陽性標(biāo)本數(shù)構(gòu)成比在SAS 8.0軟件上采用配對四格表資料的χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較；對所含例數(shù)較少的項目間比較，采用Fisher確切概率法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)NAT總體情況 在47007例獻(xiàn)血標(biāo)本中，檢測出ELISA陰性而NAT(TMA)聯(lián)檢陽性的標(biāo)本108例。通過對這108例標(biāo)本進(jìn)行NAT(TMA)鑒別檢測，檢出HBV DNA陽性40例（鑒別陽性率37.0%），未檢出HIV RNA陽性和HCV RNA陽性者。

2.2 聯(lián)檢陽性鑒別陽性標(biāo)本的分析檢測 在鑒別為HBV的40例標(biāo)本中選出了余量足的13例，進(jìn)行PCR、HBsAg中和抗體確證實驗和乙肝血清學(xué)標(biāo)志物ELISA檢測，其結(jié)果見表1。PCR能檢測出其中的9例含HBV DNA （檢測陽性重合率為69.2%），HBsAg結(jié)果均為不確定；乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中，均沒有抗原存在，不同種類抗體陽性組合呈多樣性。

2.3 聯(lián)檢陽性鑒別陰性標(biāo)本的分析檢測 對NAT(TMA)聯(lián)檢陽性但鑒別陰性的68例標(biāo)本，選出余量足的30例，進(jìn)行PCR、HBsAg中和抗體確證實驗和乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測，其結(jié)果見表2。在NAT(TMA)聯(lián)檢陽性但鑒別陰性的68例標(biāo)本中，PCR發(fā)現(xiàn)了2例含HBV DNA（檢測陰性重合率為93.3%）；HBsAg結(jié)果均為不確定；乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中，均沒有抗原存在，不同種類抗體陽性組合呈多樣性。

2.4 2種NAT方法的結(jié)果對比 選取的43例NAT（TMA）聯(lián)檢單陽性標(biāo)本，包括NAT(TMA)鑒別陽性13例、陰性30例，均進(jìn)行了PCR和乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測，TMA和PCR的檢測結(jié)果既有相同疊加，也有各自的單獨(dú)反應(yīng)性。TMA鑒別檢測陽性和陰性標(biāo)本之間，各項乙肝血清學(xué)標(biāo)志物陽性率各不相同，具體結(jié)果見表3。

3 討論

NAT的優(yōu)勢在于檢測出以往僅用ELISA不能發(fā)現(xiàn)的病毒感染[1]。在本項研究中共發(fā)現(xiàn)了108例ELISA陰性而NAT聯(lián)檢陽性的獻(xiàn)血標(biāo)本，對其進(jìn)行NAT鑒別檢測出37.0%(40/108)為HBV，其余63.0%(68/108)為陰性。本研究中HBV DNA的檢出率為0.85‰（40/47004），不僅與上海[3]、南京[4]等地區(qū)的報道基本相同，也與印度[5]報道的0.88‰接近。HBV在我國乃至世界范圍內(nèi)依然是一個較大的公共衛(wèi)生問題[6]，HBsAg檢測作為一種常規(guī)篩查手段，在采供血機(jī)構(gòu)的應(yīng)用有力地提高了血液安全性[7]。本研究對43例ELISA陰性而NAT聯(lián)檢陽的標(biāo)本進(jìn)行HBsAg中和確證實驗，沒有發(fā)現(xiàn)確證陽性，說明現(xiàn)有的HBsAg檢測特異性較好，但HBsAg陰性的血液仍然可能發(fā)生HBV的傳染[8]。HBsAg陰性血液導(dǎo)致輸血傳播HBV的殘余風(fēng)險，一般發(fā)生在血清學(xué)轉(zhuǎn)化前的窗口期或者感染末期[6]。對于HBV，NAT不僅能有效的發(fā)現(xiàn)處于HBsAg ELISA的WP獻(xiàn)血者[9]，還能檢測出隱匿性乙肝感染（occult HBV infection，OBI）獻(xiàn)血者[10，11]。

表1 2種NAT結(jié)果為HBV的標(biāo)本乙肝血清學(xué)標(biāo)志物和HBsAg確證結(jié)果比較

表2 TMA鑒別陰性標(biāo)本的PCR結(jié)果及乙肝血清學(xué)標(biāo)志物和HBsAg確證結(jié)果比較

表3 TMA聯(lián)檢單獨(dú)陽性標(biāo)本的鑒別結(jié)果和PCR結(jié)果及乙肝血清學(xué)標(biāo)志物綜合比較

一般將HBV DNA持續(xù)存在，而HBsAg為陰性的HBV感染稱為OBI[12]，OBI的發(fā)病機(jī)理尚不明確，但大多認(rèn)為是感染者和諸多病毒因子的聯(lián)合作用，將HBV的病毒復(fù)制抑制在一個可控的低水平[13]。OBI在HBV感染的整個過程中，HBsAg都呈陰性[14]。OBI中的HBsAb的陽性率約為50.0%[3]，在本研究中TMA鑒別陽性和陰性標(biāo)本中HBsAb的陽性率都在50.0%左右，之間并無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。很多情況下，OBI的唯一血清標(biāo)志物就是HBcAb[15]，包括鑒別陽性和陰性在內(nèi)的43個聯(lián)檢單陽性標(biāo)本，其乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中HBcAb陽性比例都最高，分別為84.6%和73.3%且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。NAT聯(lián)檢和鑒別均為陽性的13例標(biāo)本中有85.0%（11例）為HBcAb陽性，因此該類型標(biāo)本大部分為OBI。

在TMA聯(lián)檢單獨(dú)陽性的標(biāo)本中，出現(xiàn)了63.0%（30例）的鑒別檢測陰性，其中用PCR發(fā)現(xiàn)2例HBV，可認(rèn)為是真陽性[16]。這種聯(lián)檢和鑒別檢測結(jié)果不一致的原因，現(xiàn)在還不完全清楚，可能和檢測低載量病毒的隨機(jī)取樣差異和鑒別檢測的靈敏度有關(guān)。當(dāng)血液中病毒載量處于很低水平時，可能出現(xiàn)DNA和HBsAb等標(biāo)志物檢測的不確定性，也就是這一次能檢測到，而下一次可能檢測不到[2]，鑒別檢測陰性的標(biāo)本在聯(lián)檢時所呈的反應(yīng)性未必是假陽性[16]。因此NAT鑒別陰性的這部分標(biāo)本中，可能有HBV ELISA的WP或OBI。

本研究還發(fā)現(xiàn)TMA和PCR這2種病毒核酸檢測體系對NAT單陽性的標(biāo)本檢測能力沒有顯著性的差別（P>0.05），均能較好地勝任日常的檢測工作[17]。但究竟用哪一種能更好的檢測OBI，現(xiàn)在尚不清楚[18]。但它們有各自單獨(dú)發(fā)現(xiàn)的HBV DNA，這2種NAT方法結(jié)果不一致的主要原因可能是OBI者的血液中含低水平的HBV DNA，而NAT檢測假陰性的原因就在于病毒在血漿中含量極少，呈泊松分布型的不均勻分布[13]。我國獻(xiàn)血者HBV DNA單獨(dú)陽性中，大多（近80.0%）為OBI，且這些血液中的HBV DNA載量都較低，約在178IU/ml以內(nèi)，中位數(shù)為14IU/ml[19]，而本研究中采用的Procleix Ultro檢測HBV DNA靈敏度為30IU/ml[20]，加上病毒顆粒在血漿中呈不均勻分布導(dǎo)致每次檢測的取樣誤差造成了檢測結(jié)果的不確定[4]。

對HBV血清學(xué)標(biāo)志物5項中不同反應(yīng)性項目的組合，其不同的結(jié)果有不同的解釋[21]?？梢坏┌殡SHBV DNA的檢出就表示處于病毒攜帶狀態(tài)。因此對獻(xiàn)血標(biāo)本進(jìn)行NAT，可有效地減少窗口期、OBI導(dǎo)致的輸血傳播HBV[22]。本研究發(fā)現(xiàn)NAT聯(lián)檢單獨(dú)陽性的標(biāo)本中有37.0%鑒別為HBV，余下的63.0%鑒別陰性中存在少量的假陰性標(biāo)本[23]。NAT的單陽性標(biāo)本無論鑒別反應(yīng)性還是陰性，其乙肝血清學(xué)標(biāo)志物中的HBcAb陽性比例最高，OBI的可能性也就最大，由于OBI的HBV DNA載量低，導(dǎo)致了TMA和PCR方法的NAT結(jié)果具有一定的差異。

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