劉 玉, 張同來(lái), 楊 利, 劉 芮, 劉 影

(1. 北京理工大學(xué) 爆炸科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081; 2. 濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心, 山東 濰坊 262500)

1 引 言

以苦味酸(PA)、斯蒂酚酸(TNR)和三硝基均苯三酚(TNPG)為主的多硝基多酚及其配合物,因其熱感度和火焰感度高,易發(fā)火,并且輸出具有很高能量火焰的特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于點(diǎn)火藥的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)[1-3]。但其作為含能材料在生產(chǎn)、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)中,硝基酚類物質(zhì)會(huì)大量流失到土壤和地面沉積物中,且在自然環(huán)境條件下,硝基酚類物質(zhì)的生物降解速率緩慢,導(dǎo)致硝基酚在環(huán)境中長(zhǎng)期滯留和積累,對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。因此,多硝基酚類對(duì)環(huán)境和人類健康造成的危害備受關(guān)注。

面對(duì)嚴(yán)重的污染現(xiàn)狀,國(guó)內(nèi)外對(duì)于多硝基酚類物質(zhì)的環(huán)境控制研究集中在污染的處理、控制技術(shù)[4-7],在污染檢測(cè)方面卻相對(duì)滯后,且在對(duì)污染治理的效果監(jiān)測(cè)上采用多硝基酚類的總量進(jìn)行檢測(cè),無(wú)法對(duì)污染物進(jìn)行定性、定量分析[8]。目前,檢測(cè)其他硝基酚類的方法主要有分光光度法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11,12]、氣相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用法[13],這些相關(guān)的方法都只涉及部分硝基酚類,對(duì)于多硝基酚類特殊的強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)所適合的檢測(cè)方法研究較少。

因此定性、定量檢測(cè)這些多硝基酚化合物對(duì)于解決環(huán)境污染以及生產(chǎn)控制等問(wèn)題具有重要意義。本研究對(duì)PA、TNR和TNPG等14種硝基酚類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究,對(duì)液相色譜柱經(jīng)過(guò)大量篩選,尋找到合適的全氟苯基柱,采用超高效液相色譜法,通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化,將最初應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)單、高效的QuEChERS(快速(Quick)、簡(jiǎn)單(Easy)、價(jià)廉(Cheap)、高效(Effective)耐用(Rugged)和安全(Safe))樣品前處理方法[14-15],代替較為繁瑣的固相提取(SPE)[16-19]、加速溶劑提取(ASE)[20-22]、微波輔助提取(MAE)[23-25]和超聲波輔助提取(USE)[26-28]等前處理方法,建立了一種簡(jiǎn)單、快速的14 種硝基酚類化合物同時(shí)測(cè)定的定性、定量分析方法,為多硝基酚類含能材料及其分解產(chǎn)物的檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

AcquityTM超高效液相色譜儀(UPLC),配二極管陣列檢測(cè)器(Waters公司); AllegraTMX-22R型離心機(jī)(Beckman公司); Sk8200LH超聲波清洗器( 上海科導(dǎo)公司); Milli-QA10超純水機(jī); IKAMS3漩渦混合器; 0.45 μm過(guò)濾膜(Waters公司)。

14種硝基酚類標(biāo)準(zhǔn)品分別為2-硝基苯酚(1)、4-硝基苯酚(2)、1,2-二羥基-4-硝基苯(3)、2-硝基間苯二酚(4)、3-硝基-1,2-苯二酚(5)、2-硝基間苯三酚(6)、2,3-二硝基苯酚(7)、2,5-二硝基苯酚(8)、2,6-二硝基苯酚(9)、2,4-二硝基苯酚(10)、4,6-二硝基間苯二酚(11)、2,4,6-三硝基苯酚(12)、2,4,6-三硝基間苯二酚(13)、2,4,6-三硝基間苯三酚(14)(純度>98%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GH公司),具體見表1。吸附劑填料N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18(Agela公司)、乙腈(色譜純,德國(guó)Merck公司),甲酸、乙酸銨(分析純),實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

表1 14種硝基酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)

Table 1 Structure of fourteen nitrophenol compounds

Ｎo．compoundmolecularformulamolecularmassmolecularstructure12?nitrophenolＣ6Ｈ5ＮＯ3139．124?nitrophenolＣ6Ｈ5ＮＯ3139．131，2?dihydroxy?4?nitrobenzeneＣ6Ｈ5ＮＯ4155．142?nitroresorcinolＣ6Ｈ5ＮＯ4155．153?nitro?1，2?benzenediolＣ6Ｈ5ＮＯ4155．161，3，5?trihydroxy?2?nitrobenzeneＣ6Ｈ5ＮＯ5171．172，3?dinitrophenolＣ6Ｈ4Ｎ2Ｏ5184．182，5?dinitrophenolＣ6Ｈ4Ｎ2Ｏ5184．192，6?dinitrophenolＣ6Ｈ4Ｎ2Ｏ5184．1102，4?dinitrophenolＣ6Ｈ4Ｎ2Ｏ5184．1

續(xù)表1

Ｎo．compoundmolecularformulamolecularmassmolecularstructure114，6?dinitroresorcinolＣ6Ｈ4Ｎ2Ｏ6200．1122，4，6?trinitrophenolＣ6Ｈ3Ｎ3Ｏ7229．1132，4，6?trinitroresorcinolＣ6Ｈ3Ｎ3Ｏ8245．1142，4，6?trinitrophloroglucinolＣ6Ｈ3Ｎ3Ｏ8261．1

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 mg·L-1的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再將單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋配制成混標(biāo)儲(chǔ)備液,實(shí)驗(yàn)時(shí)以初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 QuEChERS一步提取凈化前處理方法

準(zhǔn)確稱取1.00 g土壤樣品,置于15 mL塑料離心管中,加入1 mL水浸潤(rùn)20 min,加入4 mL乙腈,渦旋提取2 min,離心后,取上清液,加入QuEChERS吸附劑,渦旋2 min,以10000 r·min-1高速離心3 min,取上清液過(guò)0.45 μm膜上機(jī)檢測(cè)。

2.4 超高效液相色譜分析條件

分析色譜柱: Accucore PFP 2.1 mm×150 mm i.d., 2.6 μm,柱溫20 ℃; 進(jìn)樣體積5 μL; 流速0.3 mL·min-1。流動(dòng)相為A：NH4Ac(10 mol·L-1)+甲酸(0.1%),流動(dòng)相B: 乙腈; 采用梯度洗脫: 0～16 min, B 25%～50%; 16～22 min,B 50%～60%; 22～23 min,B 60%～25%; 23%～25min,B25%。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

14種硝基酚類的同時(shí)快速分離需要綜合考慮化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu),色譜分離條件的優(yōu)化主要是從色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相的選擇、pH值和梯度洗脫方案等方面進(jìn)行。

3.1.1 液相色譜柱的選擇

選擇合適的色譜柱是液相分析方法的關(guān)鍵。液相色譜柱因其不同的色譜填料,不同的鍵合技術(shù)使色譜柱的選擇性也會(huì)有很大的差別。本研究?jī)?yōu)先選擇實(shí)驗(yàn)室最常使用的色譜柱: C18,C8,HILIC,T3,pheny1色譜柱。首先比較14種目標(biāo)物在以上5種色譜柱種的分離效果,結(jié)果顯示三硝基酚類物質(zhì)在以上5種色譜柱上均保留太強(qiáng),甲醇、乙腈等流動(dòng)相很難將其洗脫下來(lái),因此,以上色譜柱不適合用于多硝基多酚類物質(zhì)的檢出。

為選擇合適的色譜柱,對(duì)色譜柱填料和被測(cè)物的結(jié)構(gòu)、相互吸附性質(zhì)進(jìn)行研究,選擇對(duì)苯基化合物有特異性選擇的全氟苯基色譜柱。結(jié)果顯示,該色譜柱對(duì)14種目標(biāo)物顯示了卓越的分離能力,在優(yōu)化的色譜條件下,14種目標(biāo)物可獲得完全的基線分離。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用二極管陣列檢測(cè)器,在200～300 nm范圍內(nèi)對(duì)所有分析物進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描,14種硝基酚類物質(zhì)的紫外吸收光譜圖見圖1。結(jié)果顯示,14種化合物在220 nm附近的紫外吸收較高,同時(shí)4-硝基苯酚、 2,3-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯酚、 2,6-二硝基苯酚在270～280 nm也有較大吸收,但為同時(shí)保證14種目標(biāo)化合物的同時(shí)檢出,且檢出限盡可能小,靈敏度盡可能高,因此綜合考慮各組分的最大吸收波長(zhǎng),選擇220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.3 流動(dòng)相組成選擇

流動(dòng)相組成選擇主要是緩沖鹽體系和有機(jī)相,緩沖鹽體系主要有磷酸鹽體系和乙酸鹽體系。分別采用乙腈+水、磷酸緩沖鹽、乙酸銨緩沖鹽體系進(jìn)行梯度洗脫,對(duì)14種硝基酚類進(jìn)行分離,結(jié)果表明,乙酸銨緩沖體系和的分離效果最好,一方面乙腈的洗脫能力強(qiáng),各組分的分析時(shí)間明顯縮短,色譜峰對(duì)稱;另一方面,選擇乙酸銨體系,不但有利于分離,而且沖洗色譜柱方便。

圖1 14種硝基酚類物質(zhì)的紫外吸收光譜

Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of fourteen nitrophenol compounds

3.1.4 不同pH值對(duì)分離的影響

用甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為2～6,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)14種硝基酚類隨著流動(dòng)相的pH值降低可以改善峰形,加強(qiáng)硝基酚類物質(zhì)的保留。這主要是由于酚類等組分在中性條件下這些組分以陰離子的形式存在,與固定相之間的相互作用較弱。隨著pH值的降低,這些組分以中性分子形式存在的比例越來(lái)越大,在色譜柱上的保留也越來(lái)越強(qiáng),所以流動(dòng)相的pH值對(duì)這些化合物在色譜柱上的保留行為影響較大; 綜上所述,最終選擇流動(dòng)相中添加0.1%的甲酸,以加強(qiáng)目標(biāo)物的更好地保留。采用梯度洗脫技術(shù),選擇優(yōu)化的最佳色譜條件,將14種硝基酚混合標(biāo)準(zhǔn)樣品在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了有效分離,分離度好,峰形對(duì)稱尖銳,無(wú)明顯拖尾。14種硝基酚標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖見圖2。

3.2 QuEChERS一步提取凈化樣品前處理方法中吸附劑的選擇

土壤等環(huán)境樣品經(jīng)QuEChERS提取、吸附劑凈化,取上清液過(guò)膜待測(cè)。方法簡(jiǎn)便、操作誤差小,適合同時(shí)測(cè)定多殘留物的日常檢驗(yàn)。

吸附劑對(duì)回收率的影響既因?yàn)槲絼?duì)分析物的吸附作用,又與吸附劑對(duì)雜質(zhì)的吸附凈化效果可能導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)有關(guān),以致影響分析物在超高效液相色譜中的響應(yīng)值。吸附劑的選擇取決于樣品提取物中的脂肪、蛋白、色素等大分子有機(jī)物或者雜質(zhì)等的含量。

圖2 14種硝基酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

Fig.2 Liquid chromatogram of fourteen nitrophenol compound standard samples

土壤樣品中存在脂肪、動(dòng)植物殘留、色素等雜質(zhì),為選擇合適的吸附劑,比較了C18、GCB+C18、PSA+C18不同的吸附劑凈化的樣品回收率,回收結(jié)果見圖3。由圖3可見, GCB+C18吸附劑的回收率最高,說(shuō)明該吸附劑對(duì)分析物吸附作用較小; 且由圖4可知,經(jīng)GCB+C18吸附劑填料處理的空白土壤加標(biāo)樣品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)比,可以看到處理后的土壤基質(zhì)僅有少許雜峰,對(duì)目標(biāo)物的分離度和峰形均無(wú)影響,說(shuō)明該組合吸附劑同時(shí)對(duì)脂肪、蛋白和植物片狀結(jié)構(gòu)色素等雜質(zhì)的凈化效果較好,因此選擇GCB+C18作為吸附劑。

圖3 不同吸附劑填料對(duì)14種硝基酚類物質(zhì)的回收率的影響

Fig.3 Effect of different sorbent on the recovery of fourteen nitrophenol compounds

圖4 土壤基質(zhì)中14種硝基酚類物質(zhì)的的液相色譜

Fig.4 Liquid chromatogram of fourteen nitrophenolic compounds in soil

同時(shí)由土壤基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖4看出,前處理方法凈化后基質(zhì)效應(yīng)較小,可以使用標(biāo)準(zhǔn)溶液直接定量,方法更簡(jiǎn)便。

3.3 方法的線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,以配制0.2～50mg·L-1系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以各組分峰面積(Y)對(duì)濃度(X,mg·L-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2結(jié)果表明,14種硝基酚類在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9985～0.9995,可以滿足定量分析的要求。按3倍信噪比(S/N)計(jì)算土壤中14種硝基酚的檢出限(LOD)為0.04～0.06 mg·kg-1。

表2 在土壤空白基質(zhì)中14種硝基酚類物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

Table 2 Linear equations, correlation coefficients, LOD of fourteen nitrophenol compounds in blank substrate soil

compoundslinearequationregressioncoefficientＬＯＤ／mg·kg－11Ｙ＝10876Ｘ－47890．99870．062Ｙ＝11345Ｘ＋57390．99910．053Ｙ＝10987Ｘ－8730．99900．064Ｙ＝12352Ｘ－97390．99950．055Ｙ＝11372Ｘ＋37860．99910．056Ｙ＝12957Ｘ－72890．99850．057Ｙ＝10876Ｘ＋76530．99920．058Ｙ＝11265Ｘ＋45890．99820．059Ｙ＝11376Ｘ＋67520．99920．0510Ｙ＝12750Ｘ－76390．99930．0511Ｙ＝10453Ｘ－87650．99920．0612Ｙ＝13659Ｘ－47850．99840．0413Ｙ＝119327Ｘ－76390．99880．0514Ｙ＝10893Ｘ－89870．99900．06

3.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

在0.2,1.0,10 mg·kg-1水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次,14種硝基酚的平均回收率為81.3%～105.7%; 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～5.9%; 均符合痕量殘留檢測(cè)的要求(表3)。

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性,選擇采集幾個(gè)土壤樣品,包括農(nóng)田、化學(xué)工業(yè)區(qū)、某合成區(qū)域附近三個(gè)不同地區(qū),采用本方法進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果見表5。被測(cè)的農(nóng)田未檢出目標(biāo)化合物,而化學(xué)工業(yè)區(qū)土壤樣品檢出有少量4-硝基苯酚、2,4-二硝基苯酚,某合成區(qū)域附近土壤檢出含有一定濃度的2,4,6-三硝基間苯二酚。

表3 在土壤空白基質(zhì)中14種硝基酚類物質(zhì)的添加回收率、精密度

Table 3 Recoveries and RSD of fourteen nitrophenol compounds in blank substrate of soil

compoundsrecoveries（％，n＝5）lowmiddlehighrelativestandarddeviation（％，n＝5）lowmiddlehigh185．792．694．84．84．23．2283．391．594．65．55．34．2385．692．293．55．74．54．3486．293．592．65．34．94．95105．792．696．75．14．34．0684．392．198．15．64．33．8787．693．696．15．94．95．1888．288．883．85．55．45．0989．589．592．45．34．45．21083．990．185．35．53．94．61182．887．481．35．44．04．31286．488．983．55．25．33．61390．784．295．25．75．25．61491．486．890．75．34．23．8

表4 不同區(qū)域土壤的檢測(cè)結(jié)果

Table 4 Detection of fourteen nitrophenol residues in different areas of the soil mg·kg-1

Note: ND is not detectable.

4 結(jié) 論

首次采用改進(jìn)的一步QuEChERS前處理方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)強(qiáng)極性、難分離、熱不穩(wěn)定的三硝基苯酚、 三硝基間苯二酚和三硝基均苯三酚等14種硝基酚類化合物在同一液相色譜條件下的分離、測(cè)定。該方法考察了前處理不同吸附劑的凈化效果,簡(jiǎn)化了前處理的步驟,獲得到了較高的回收率和較好的凈化效果。液相方法選擇全氟苯基色譜柱,以乙腈和NH4Ac(10 mol·L-1)+甲酸(0.1%)作為流動(dòng)相,梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,在優(yōu)化的QuEChERS前處理和液相色譜分離分析條件下,14種硝基酚類化合物在22 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全基線分離,檢出限為0.02～0.04 mg·L-1回收率為81.3%～105.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.6%～5.9%。由實(shí)際環(huán)境樣品的檢測(cè)結(jié)果可知,本方法具有簡(jiǎn)便快捷、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn),能夠滿足土壤、地面沉積物等環(huán)境樣品中痕量硝基酚類污染物檢測(cè)的要求,可用于含能材料多硝基酚類化合物及其分解物定性和定量的快速分析。

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