陳宗凱，趙偉，路鍵，顏丙松，姬文超，張炳遠(yuǎn)

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，山東 青島 266003)

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膽管癌組織中Wnt2b蛋白表達(dá)及其臨床意義

陳宗凱，趙偉，路鍵，顏丙松，姬文超，張炳遠(yuǎn)

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，山東 青島 266003)

目的 觀察Wnt2b蛋白在膽管癌組織的表達(dá)，并探討其在膽管癌發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的臨床意義。方法 采用免疫組化染色方法檢測(cè)60例膽管癌及30例膽管正常組織中Wnt2b蛋白的表達(dá)情況，并分析其與膽管癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果 Wnt2b在膽管癌組織的陽(yáng)性率(90.00%)明顯高于正常膽管組織(3.33%)，差異有顯著性(χ2=38.13，P<0.01)。Wnt2b表達(dá)與膽管癌的浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)(Z=-3.171、-3.316，P<0.01)，而與病人的年齡、性別、膽管癌發(fā)生部位及膽管癌的分化程度無(wú)關(guān)(Z=-0.048～-1.020，P>0.05)。結(jié)論 Wnt2b蛋白可能作為評(píng)估膽管癌臨床分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一種有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)記。

Wnt2b蛋白；膽管腫瘤；病理學(xué),臨床

膽管癌是一種原發(fā)于左右肝管匯合部至膽總管下端的肝外膽管惡性腫瘤，其臨床特點(diǎn)是具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移早，臨床可采用手術(shù)、放射、化學(xué)等方法進(jìn)行治療，但預(yù)后較差[1-3]。膽管癌惡性程度高，是最致命的惡性腫瘤之一[4]。臨床上膽管癌主要表現(xiàn)為伴有上腹部不適的進(jìn)行性黃疸，早期沒(méi)有典型的臨床體征。因此，研究膽管癌發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可以提高對(duì)膽管癌病人的診治水平。Wnt2b是Wnt家族中具有高度保守性的分泌型因子，近年來(lái)諸多研究已證實(shí)，Wnt2b與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。并且Wnt途徑是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑，通路的異常激活或調(diào)節(jié)通路的蛋白功能發(fā)生改變均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察Wnt2b在膽管癌及正常膽管組織的表達(dá)，進(jìn)而探討Wnt2b與膽管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

2008年12月—2013年12月，我院經(jīng)手術(shù)切除后石蠟包埋的膽管病理組織標(biāo)本90例，其中膽管癌組織標(biāo)本60例，正常膽管組織標(biāo)本30例(均來(lái)源于肝移植病人的正常膽管組織，并經(jīng)病理證實(shí))。60例膽管癌均為腺癌，其中男43例(占71.67%)，女17例(占28.33%)，年齡為30～82歲，中位數(shù)年齡為56歲。在膽管癌病人中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例(占76.67%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例(占23.33%)。按病理分型，高分化18例(占30%)，中低分化42例(占70%)。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期，其中T1+T2期16例(占26.67%)，T3+T4期44例(占73.33%)。所有病人術(shù)前均未做過(guò)放、化療治療。所有標(biāo)本均采用40 g/L中性甲醛溶液固定后，石蠟常規(guī)包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采取蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2 方法

采用免疫組化PV-6000二步法檢測(cè)Wnt2b在膽管癌及正常膽管組織的表達(dá)，并分析其差異性及與臨床特征的關(guān)系。試劑來(lái)源：鼠抗人Wnt2b多克隆抗體(ab50575)購(gòu)自Abcam公司，小鼠超敏二步法免疫組化PV-6000和DAB檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果及判定

以細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒狀作為Wnt2b蛋白陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。Wnt2b蛋白陽(yáng)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：通過(guò)隨機(jī)選擇8～10個(gè)視野(100倍)的陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)目來(lái)進(jìn)行半定量評(píng)估，分為4級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽(yáng)性(+)，26%～50%陽(yáng)性()，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性()。所有標(biāo)本均經(jīng)2名病理科高年資主治醫(yī)師審核證實(shí)。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt2b在膽管癌、正常膽管組織中的表達(dá)

Wnt2b蛋白在膽管癌組織和正常膽管組織的陽(yáng)性率分別為90.00%(54/60)和3.33%(1/30),前者明顯高于后者，差異有顯著意義(χ2=38.13，P<0.01)。見圖1和表1。

2.2 Wnt2b在膽管癌組織表達(dá)及其與臨床病理因素關(guān)系

膽管癌組織中Wnt2b的表達(dá)與膽管癌的浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Z=-3.171、-3.316，P<0.01)，而與病人年齡、性別、膽管癌發(fā)生部位和分化程度等無(wú)關(guān)(Z=-0.048～-1.020，P>0.05)。Wnt2b蛋白在T3+T4期的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1+T2期(Z=-3.171，P<0.01)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽管癌標(biāo)本W(wǎng)nt2b的表達(dá)率明顯增高(Z=-3.316，P<0.01)。提示W(wǎng)nt2b可能參與了膽管癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。見表2。

3 討 論

膽管癌在我國(guó)人群中的發(fā)病率較高，約占全球的55%[6]。膽管癌的手術(shù)切除是最主要的治療方案，然而盡管近幾年膽管癌R0根治性切除率上升到64%～71%，但切除后的5年生存率僅提高到21%～30%[7]，這可能是由于腫瘤早期便發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，而手術(shù)無(wú)法完全切除轉(zhuǎn)移灶所致。因此，研究膽管癌發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可以提高對(duì)膽管癌病人的診治水平。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，Wnt家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、增生和凋亡中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用[8-10]。Wnt2b位于人的常染色體1p13上，在19個(gè)人類的Wnt基因家族中屬于高保守的分泌型因子，主要是通過(guò)經(jīng)典的Wnt途徑來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[11]。Wnt2b是與胚胎相關(guān)基因[12]，也是目前Wnt家族中研究發(fā)現(xiàn)的與消化道腫瘤的關(guān)系較為密切的一個(gè)基因[13-14]。近年來(lái)諸多研究已證實(shí)，Wnt2b與胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、惡性胸膜間皮瘤、乳癌、膠質(zhì)瘤和惡性黑色素瘤等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。而KATOH[14]的研究也證實(shí)，Wnt2b在腫瘤組織中有明顯的上調(diào)。迄今為止Wnt2b與膽管癌關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果表明，Wnt2b在膽管癌組織表達(dá)率明顯高于正常膽管組織，并且與膽管癌的浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示，Wnt2b蛋白可能參與了膽管癌的發(fā)生發(fā)展。另外，也提示W(wǎng)nt2b可能參與了膽管癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

表1 Wnt2b在膽管癌及正常膽管組織表達(dá)(例)

a：Wnt2b蛋白在正常膽管組織中的表達(dá)；b：Wnt2b蛋白在膽管癌組織的表達(dá)。PV-6000染色，200倍。

表2 Wnt2b在膽管癌組織表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Wnt2b蛋白可能作為評(píng)估膽管癌臨床分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)記。

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(本文編輯 牛兆山 于國(guó)藝)

EXPRESSION OF Wnt2b IN CHOLANGIOCARCINOMA AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE

CHENZongkai,ZHAOWei,LUJian,YANBingsong,JIWenchao,ZHANGBingyuan

(Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo observe the expression of Wnt2b protein and investigate its clinical significance in the development, progression, invasion and metastasis of cholangiocarcinoma (CLC).MethodsEmploying immunohistochemical method, the expression of Wnt2b protein in tissues of 60 cases of CLC and 30 normal bile duct tissues was detected, and its relationship with clinical characteristics of this malignancy was analyzed.ResultsThe positive rate of Wnt2b was significantly higher in CLC than that in normal bile duct tissue (90.00% vs. 3.33%,χ2=38.13,P<0.01). The expression of Wnt2b was positively correlated with depth of tumor invasion and lymph node metastasis (Z=-3.171,-3.316;P<0.01), but it was not related to patient’s age, gender, tumor location and cell differentiation (Z=-0.048--1.020,P>0.05).ConclusionWnt2b is probably to be used as a useful biological marker for assessing clinical stage and lymph node metastasis of cholangiocarcinoma.

Wnt2b protein; bile duct neoplasms; pathology, clinical

2015-03-10;

2015-06-01

陳宗凱(1986-)，男，碩士研究生。

張炳遠(yuǎn)(1962-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail:bingyuanzhang@126.com。

R735.8

A

1008-0341(2015)04-0409-03