賀東生，陳小芬，王 飛，蘇丹萍，陳瑞愛，尤劉陽

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

豬丁型冠狀病毒又稱豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV），是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，它主要感染整段小腸，尤其是空腸和回腸，引起嚴(yán)重的腸炎并伴有小豬的腹瀉和嘔吐[1]。2009—2010年P(guān)DCoV在中國香港首次報(bào)道該病毒[2-3]。2014年初，在美國首次報(bào)道豬群該病的流行，此后至少有19個(gè)州有該新型冠狀病毒的報(bào)道。在美國，豬丁型冠狀病毒感染與豬流行性腹瀉（PED）和豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床發(fā)病情況比較相似，但是發(fā)病癥狀相對較輕。新型豬腸道冠狀病毒病可引起乳豬腹瀉和嘔吐，發(fā)病率和死亡率高達(dá)50%～100%，生長豬和成年豬感染后死亡率低?，F(xiàn)將本次病例報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

來自華南某集約化豬場（2?000頭基礎(chǔ)母豬）3～7日齡的乳豬5頭，全場乳豬發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，傳播迅速，發(fā)病率90%、死淘率90%以上。采集發(fā)病豬的小腸，按1∶5研磨制備成病料，-80?℃凍存待檢。

1.2 主要試劑

RNA抽提試劑盒購于上海百賽生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、18T載體克隆試劑盒、DL2000?DNA?Marker、膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購自TAKARA公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)GenBank所發(fā)布的序列號，選擇N基因，運(yùn)用Primer?Premier5.0?分別針對PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV（豬輪狀病毒）設(shè)計(jì)4對引物，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增的特異性基因片段大小為482?bp、450?bp、810?bp 和 620?bp。

1.4 總 RNA 的提取

病料經(jīng)離心取上清液，按照ANYGEN核酸提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，然后用物RNA酶的水溶解，放在-80℃保存。

1.5 RT-PCR 的檢測

反轉(zhuǎn)錄體系：ddH2O?4?μL，下游引物 R?1μL，RNA?1μL，70?℃水浴 10?min 冰浴 2?min ；5×MLV?buffer?2μL，ddH2O?1μL，dNTPs?0.5μL，RNA 酶 抑 制 劑?0.25μL，MLV 反轉(zhuǎn)錄酶?0.25μL，42?℃水浴 1?h，72?℃水浴 15?min冰浴至冷卻。

PCR 體 系 ：ddH2O?32.5μL，10×MLV?buffer?5μL，dNTPs?4μL，F(xiàn)?2μL，R2μL，?cDNA?4μL，rTaq?0.5μL。反 應(yīng) 條 件 為 94?℃?5?min，94?℃?30?s，52?℃?30?s，72?℃?30?s，30Cycles?，72?℃?7?min，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 克隆

將陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與PMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后挑單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒送往睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 PDCoV參考毒株N基因序列信息?

1.7 序列分析

將RT-PCR擴(kuò)增獲得的N基因進(jìn)行克隆、測序，利用MEGA6軟件處理，與GenBank上已公布的PDCoV毒株的N基因序列（表1）進(jìn)行同源性比對分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病豬癥狀和病變

該集約化豬場5至15日齡乳豬發(fā)生傳播迅速的嚴(yán)重腹瀉，迅脫水死亡，死淘率高達(dá)90%以上。癥狀見剖檢病變見圖1和圖2。主要在小腸,腸管明顯擴(kuò)張,內(nèi)充滿黃色液體,腸壁變薄、松弛、小腸黏膜充血,腸系膜呈索狀充血。

圖1 發(fā)病豬的臨床癥狀

圖2 發(fā)病豬小腸的病變

2.2 4種病毒N基因擴(kuò)增

應(yīng)用RT-PCR方法對樣品進(jìn)行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV檢測，結(jié)果顯示PEDV/TGEV/RTV未能擴(kuò)增出目的條帶，而PDCoV擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致片段，約482?bp，電泳圖見圖3。檢測結(jié)果顯示該病料PEDV/TGEV/RTV為陰性，PDCoV為強(qiáng)陽性，說明該豬場可能存在PDCoV的感染。

圖3 4種病毒PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 PDCoV?N 基因序列分析

由測序結(jié)果可知，Ch-A測序的N基因中間存在一個(gè)核苷酸的缺失、幾個(gè)突變。運(yùn)用DNAstard軟件將測序正確PDCoV?N基因序列與GenBank上已發(fā)表的國內(nèi)外毒株N基因參考序列進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果顯示獲得PDCoV毒株N基因之間的核苷酸序列同源性為98.3%到100%，氨基酸序列同源性為95.0%到100%；其中TX與中國已公布毒株相比核苷酸同源性為98.3%到99.0%，氨基酸同源性為95.0%到96.9%，顯示與中國香港毒株HKU15-155同源性最低；與韓國和美國毒株相比核苷酸同源性為98.8%～99.0%，氨基酸同源性為96.2%到96.9%（結(jié)果見圖4、圖5）。

2.4 PDCoV?N 基因遺傳進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA?6.06軟件繪制N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明我國新出現(xiàn)的豬丁型冠狀病毒（Ch-A）與國內(nèi)外報(bào)道的豬丁型冠狀病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，它單獨(dú)在一個(gè)新的分支上。說明這是在我國新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新毒株（結(jié)果見圖6）。

3 討論

自2013年至今，新出現(xiàn)的PEDV和PDCoV已遍布美國，造成大量豬死亡。目前國際上正在形成該病毒相關(guān)研究熱點(diǎn)，也發(fā)表了少量的報(bào)告。但國內(nèi)至今未見該病毒為主因在豬場暴發(fā)和流行的報(bào)道。

我們首次報(bào)道了國內(nèi)集約化豬場暴發(fā)豬丁型冠狀病毒病。通過設(shè)計(jì)4對冠狀病毒引物，在檢測PEDV、TGEV和RTV為陰性后，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PDCoV，顯示為強(qiáng)陽性。對PDCoV?HN株的N基因進(jìn)行測序，并與國內(nèi)外已公布的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示：該P(yáng)DCoV毒株（Ch-A）與GenBank上公布的美國株及中國株不在一個(gè)分支上，是新發(fā)現(xiàn)的一株新型冠狀病毒病。該分支的毒株是否與本次發(fā)病的高致病力有關(guān)值得深入研究。仍然未知該病毒是怎么傳入我國及其在我國各地的感染情況。

老病未消除、新病涌現(xiàn)，需高度重視和立即加強(qiáng)研究對豬丁型冠狀病毒的監(jiān)測和系統(tǒng)性研究，降低給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失和威脅。

圖4 PDCoV N基因核苷酸序列同源性比較

圖5 PDCoV N基因氨基酸序列同源性比較

圖6 我國新出現(xiàn)的與國內(nèi)外現(xiàn)有的豬丁型冠狀病毒N基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

[1]?Opriessnig?T.Re-emergence?of?porcine?epidemic?diarrhea?virus?in?the?global?pig?population[J].?The?Veterinary?Journal,?2015.204(2):131.

[2]?Lee?S，Lee?C.Functional?characterization?and?proteomic?analysis?of?the?nucleocapsid?protein?of?porcine?deltacoronavirus[J].?Virus?Research,?2015.208:136-145.

[3]?Wang?L,Byrum?B，Zhang?Y.Detection?and?Genetic?Characterization?of?Deltacoronavirus?in?Pigs,Ohio,USA,?2014[J].?Emerging?Infectious?Diseases,?2014.?20(7).