劉志國，崔步云，王 妙，劉日宏，夏咸柱

布氏菌分離株16SrDNA基因遺傳進化分析

劉志國1,2，崔步云3，王 妙2，劉日宏2，夏咸柱1,4

目的 檢測內蒙古布氏菌臨床分離株的16SrDNA基因序列，構建16SrDNA遺傳進化樹，確定該菌株的分類地位。方法 用BCSP31-PCR對臨床分離株檢測，再進行16SrDNA雙向測序；從GeneBank下載標準參考菌株和與布氏菌有共同抗原細菌的16SrDNA基因序列；用Mega6.0進行序列比對并構建遺傳進化樹。結果 BCSP31-PCR結果顯示均有223 bp擴增條帶，16SrDNA測序得到單一基因序列；比對后發(fā)現(xiàn)有4處特異片段，經(jīng)Blast比對，位于844-1224包括380 bp的片段為布氏菌獨有；進化樹顯示布氏菌臨床分離株與標準菌株聚在1個末端分支上，遺傳距離接近0，無法精細區(qū)分相互關系；與人蒼白桿菌聚集在1個亞分支上，遺傳距離0.019；與其它試驗菌株如霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾菌遺傳進化距離較遠，遺傳距離>0.02。結論 從遺傳進化角度對布氏菌分離株與標準菌株的親緣關系進行分析，布氏菌所有種型遺傳距離接近，提示布氏菌16SrDNA為高度保守序列，不宜做遺傳進化分析的靶基因；布氏菌與人蒼白桿菌有較近的親緣關系；布氏菌屬16SrDNA特有的380 bp的基因片段可作為布氏菌快速鑒定的靶序列。

布氏菌；16S rDNA；遺傳進化；分析

布氏菌病(brucellosis)是由布氏菌引起的人獸共患傳染病，世界范圍廣泛流行，在我國流行的主要是羊、牛種布氏菌；羊種菌造成人間布病的暴發(fā)，而牛種、豬種菌則多引起散發(fā)[1-3]。

近年，細菌的分類學方法發(fā)展飛速，已從單一的表型分類發(fā)展為系統(tǒng)性分類即利用表型、遺傳型和系統(tǒng)發(fā)育信息等多種途徑來區(qū)分細菌，進而闡述細菌的遺傳進化關系。特以16S rDNA基因序列測定鑒定布氏菌并闡述其進化關系[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器試劑 生物安全柜(美國Thermo)，梯度PCR擴增儀、PCR管離心機、高速離心機均為德國Sigma公司；電泳儀(北京八一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。DL2000 Marker(全氏金生物公司)；DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)；BCSP31-PCR引物由天一輝遠生物公司完成。

1.1.2 菌株來源 牛種標準菌株544A羊種標準菌株16M，大腸桿菌O∶157DNA均來自中國疾控中心傳染病所布病室。布氏菌臨床分離株系2012-2014年分離自來烏蘭察布市地方病防治中心就診的布病患者血液樣本，共20株，患者均來源于烏蘭察布市的8個旗縣，患者均有養(yǎng)羊史或羊接觸史，菌株編號為：C1～C17，C19、C21和C22。

1.1.3 細菌DNA的提取 按照天根細菌基因組提取試劑盒推薦步驟進行。

1.1.4 擴增引物 布氏菌屬聚合酶鏈式反應(BCSP31-PCR)擴增引物參照參考文獻[6]。

1.2.3 測序 將BCSP31-PCR擴增后，20株代表性陽性菌株DNA送天一輝遠生物公司進行16SrDNA全序列測定。

1.2.4 序列比對 用Mega6.06軟件中的ClustalW功能，對試驗菌株的序列比對，并查找特異序列。

1.2.5 遺傳進化樹的構建 將上述比對結果導入Mega6.06軟件中，采用Neighbor-Joining法，構建試驗菌株16S rDNA進化樹。

2 結 果

2.1 布氏菌BCSP31-PCR擴增結果 BCSP31-PCR擴增結果電泳顯示所有臨床分離菌株均在約223 bp處有擴增條帶，與參考菌株一致。

2.2 16S rDNA測序結果 測序取得了單一的核苷酸序列，然后根據(jù)測序峰值圖刪除兩端可信度較差的序列，所有測序菌株均得到了約為1 350 bp大小的基因序列，上述序列經(jīng)Blast比對顯示：Expect為0.0；Identities為100%，證實該菌株序列與布氏菌的16S rDNA基因序列100%吻合。

2.3 布氏菌臨床分離株、標準菌株和與布氏菌有共同抗原細菌的16S rDNA比對結果 用ClustalW軟件做上述序列比對后發(fā)現(xiàn)臨床分離株和布氏菌標準株在16S rDNA基因上差異甚微；以B.abortus544A(GeneBankNR：042460)為基準，在位置101-142(序列：5′-GGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCATTT-3′)、228-260(序列：TGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAG

TTGGTGG)和844-1224(序列：5′-CGGGGTGTTTACACTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAA

ACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA

TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG

CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG

AAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTG

ACATCCCGGTCGCGGTTAGTGGAGACACT

ATCCTTCAGTTAGGCTGGACCGGAGACAG

GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCA

TTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGAC

GTCAAGTCCTCATGGCCC-3′)有3處特異性序列；對這3段特異性序列在NCBI做BLAST，發(fā)現(xiàn)位于844～1224處包含380 bp的核苷酸序列為布氏菌屬基因特異性片段，見圖1。

2.4 遺傳進化樹構建結果 以16S rDNA基因構建的上述試驗的遺傳進化樹表明，布氏菌臨床分離株與標準參考菌株緊密聚集在進化樹的同一末端分支上，遺傳距離幾乎相同，無法精細區(qū)分相互關系；與人蒼白桿菌聚集形成了分支，未與布氏菌屬聚為一類，遺傳距離約為0.019，提示有較近的親緣關系；其他實驗菌株如霍亂弧菌、巴爾通體，包括與布氏菌交叉凝集的耶爾森菌O∶9型，均聚集在了不同的分支中，提示遺傳進化距離較遠，親緣關系較遠。見圖2。

圖1 布氏菌16S rDNA 844～1224處的部分特異序列

圖2 布氏菌臨床分離株16S rDNA遺傳進化樹

Fig.2 Phylogenetic tree of clinical isolates ofBrucellastrains 16S rDNA

3 討 論

目前，布氏菌病診斷檢測和基因特征分析的方法多樣，血清學方法操作簡單、快速適用，但由于許多菌株與布氏菌有共同抗原，容易發(fā)生交叉反應[7]，導致誤診、漏診；傳統(tǒng)的微生物學檢測方法操作繁瑣、周期長、且有約10%～30%的菌株成為無法鑒定的非典型菌株[8]。所以，布氏菌的分離培養(yǎng)仍是布病感染的金標準，亦是進行基因研究和闡明遺傳進化關系的基礎。布氏菌16S rDNA基因序列分析，可以對布氏菌進行快速、準確的分類鑒定，還可用于確定菌株的分類地位、種系發(fā)生[9]。

細菌的16S rDNA 普遍存在于原核生物中，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鐘，其分子中既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域即含有具有交替的保守區(qū)域和異質性區(qū)域的特點[10]，它適用于進化距離不同的各類生物親緣關系的研究。本文對20株布氏菌進行16S rDNA序列測定及遺傳進化分析，BCSP31-PCR的鑒定均為布菌屬。BCSP31-PCR方法在屬的水平上鑒定布氏菌菌株，是OIE推薦鑒定方法之一。16S rDNA基因序列測定，BLAST結果顯與布氏菌屬標準菌株序列相似性為100%；顯示16S rDNA基因序列在布氏菌屬中高度保守，與先前研究結果一致[11]。以牛種布氏菌的16S rRNA 全序列 (GenBank：NR_114469)為基準，在位置101-142 有3處為布氏菌屬基因特異性片段，可作為快速分型鑒定的靶序列，可用于建立布氏菌的快速鑒定。進化樹是用樹狀結構來表示物種或者序列之間的演化關系，揭示物種隱含的種系關系,在進行分子進化中研究重要意義。本試驗基于試驗菌株的16S rDNA基因，采用鄰接法(NJ)構建了布氏菌及相關菌株的分子進化樹。本試驗構建的遺傳進化樹顯示遺傳距離為0.02，即試驗菌株核苷酸序列同源性差異為2%即同源性為98%，代表試驗菌株基因中每100個核苷酸/氨基酸中有2個不同；進化樹的Bootstrap檢驗值均在97以上，表明該進化樹可信度較高，一般該值大于70較為可信[12]。進化分析結果顯示不同地域、年代、種型的臨床分離株與標準參考菌株聚集在進化樹的末端分支上，表明分離株均為布氏菌，但遺傳距離很接近，無法精細的區(qū)分種型和相互關系，這與 Boye K等[13]的研究結果一致。進化樹提示布氏菌16SrDNA為高度保守序列，適合種屬鑒定，不宜做遺傳進化分析的靶基因，應選擇保守性相對較差的基因構建進化樹；而布氏菌與人蒼白桿菌聚集在了一個亞分支上，且16S rDNA基因同源性較高，遺傳距離約為0.019，提示有較近親緣關系，這與Velasc J等[14]的試驗結果相吻合；布氏菌屬與其它試驗菌株如霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾菌等聚集在不同的進化分支上，遺傳進化距離較遠，提示親緣關系相對較遠。分離株C17在用常規(guī)試驗方法鑒定時，鑒定為可疑布氏菌株，而16S rDNA序列測定結果顯示該菌株為布氏菌屬細菌，表明布氏菌16S rDNA序列測定在非典型株或可疑菌株的分類鑒定中具有較好的作用。

16SrDNA已廣泛地應用于細菌遺傳特征和分子差異的研究，尤其適用于臨床中不能或不易培養(yǎng)的病原和未知病原的分類鑒定，大量已知細菌的16SrDNA數(shù)據(jù)都被測定并輸入到國際基因數(shù)據(jù)庫,使之成為對細菌鑒定和分類非常有用的參照系統(tǒng)；而且16SrDNA序列的相似性已成為劃分屬的標準,屬內相似性不低于95%[15]。布氏菌16S rDNA序列測定不僅試驗結果直觀、分類鑒定準確、信息易于電子存檔，便于構建數(shù)據(jù)庫；而且能夠進行布氏菌遺傳進化、分子差異等方面的試驗研究。

[1]Bureau of Disease Control and Prevention, Ministry of Health. Manual of brucellosis control[M]. Beijing: People’s Health Publish House, 2008. (in Chinese) 衛(wèi)生部疾病預防控制局.布魯氏菌病防治手冊[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2008:55.

[2]Liu ZG, Ren QH, Wang M, et al. Overview of specific serological detection technologies for brucellosis[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(10): 1026-1031. (in Chinese) 劉志國,任清華,王妙,等.布病特異性血清學檢測技術應用概述[J].中國人獸共患病學報.2013, 29(10): 1026-1031.

[3]Cui BY. Disease surveillance and control of chain brucellosis[J]. Dis Survill, 2007, 22(10): 649-651. (in Chinese) 崔步云.中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制[J].疾病監(jiān)測，2007;22 (10): 649-651.

[4]Woese CR. Bacterial evolution[J]. Microbiol Rev, 1987, 51: 221-227.

[5]Jenkins C,Ling CL,Ciesielczuk HL. Detection and identification of bacteria in clinical samples by 16S rRNA gene sequencing: comparison of two different approaches in clinical practice[J]. J Med Microbiol, 2012, 61(Pt 4): 483-488. DOI:10.1099/jmm.0.030387-0

[6]Liu ZG, Cui BY, Liu RH, et al. Isolation and identification of human brucellosis pathogens in Ulanqab of Inner Mongolia[J]. Chin J Endemiology, 2014, 33(1): 49-52. (in Chinese) 劉志國,崔步云,劉日宏,等.內蒙古烏蘭察布市人間布魯桿菌病病原菌的分離鑒定[J]. 中華地方病學雜志,2014,33(1):49-52.

[7]Nielsen K. Diagnosis of brucellosis by serology[J]. Vet Microbiol, 2002, 90(1-4): 447-459.

[8]Cui BY, Yin JM, Li LY, et al. Typing ofBrucellaisolates by repetitive element sequence-base polymerase chain reaction[J]. Dis Survill, 2005, 20(8): 397-400. (in Chinese) 崔步云,尹繼明,李蘭玉,等.布魯氏菌的Rep-PCR分型研究[J].疾病監(jiān)測,2005,20(8): 397-400.

[9]Fox GE, Stackebrandt E, Hespell RB, et al. The phylogeny of prokaryotes[J]. Science, 1980, 209(4455): 457-463.

[10]Wolk D, Mitchell S, Patel R. Principles of molecular microbiology testing method[J]. Infect Dis Clin North Am, 2001, 15(4): 1157-1204.

[11]Tang X, Jiang H, Zhao HY, et al. Application of the 16S rDNA sequence analysis method in identification ofBrucella[J]. Microbiology, 2013, 40(7): 1290-1296. (in Chinese) 湯旭,姜海,趙鴻雁,等.16Sr DNA序列分析在鑒定布魯氏菌中的應用[J].微生物學通報.2013, 40(7): 1290-1296.

[12]Xue ZQ. Tools for analysis of DNA and protein sequence data[M]. 3rd ed. Beijing: Science Press, 2014: 61. (in Chinese) 薛慶中,等.DNA和蛋白質序列數(shù)據(jù)分析工具[M].3版.北京：科學出版社，2014,06:61.

[13]Boye K, Hansen DS. Sequencing of 16S rDNA ofKlebsiella: taxonomic relations within the genus and to otherEnterobacteriaceae[J]. Int J Med Microbiol, 2003, 292(7-8): 495-503. DOI:10.1078/1438-4221-00228

[14]Velasco J, Romero C, Lopez-Goni I, et al. Evaluation of the relatedness ofBrucellaspp. andOchrobactrumanthropiand description ofOchrobactrumintermediumsp. nov., a new species with a closer relationship toBrucellaspp[J]. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48 (Pt 3): 759-768. DOI:10.1099/00207713-48-3-759

[15]Woo PC, Lau SK, Teng JL, et al. Thenand now: use of 16SrDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories[J]. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(10): 908-934. DOI:10.1111/j.1469-0691.2008.02070.x

s: Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

Gene genetic evolution of 16SrDNA forBrucellastrains

LIU ZHi-guo1,2,CUI Bu-yun3,WANG Miao2,LIU Ri-hong2,XIA Xian-zhu1,4

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2.UlanqabCentreforEndimicDiseaseControl,Ulanqab012000,China;3.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China;4.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

We detected 16SrDNA gene sequence ofBrucellastrains of Inner Mongolia clinical isolates and constructed 16SrDNA phylogenetic tree, in order to determine the taxonomic status. Clinical isolates were identified by BCSP31-PCR, and then the 16SrDNA was bidirectionaly sequenced; 16SrDNA gene sequences ofBrucellareference strains and present common antigen bacteria withBrucellawere downloaded from the GenBank; sequence was aligned by Mega6.0 and phylogenetic tree of experimental strains was constructed. Results showed that 223 bp specific fragments were amplified from allBrucellaclinical isolates by BCSP31-PCR; single sequence was obtained by 16SrDNA sequencing. By the sequence alignment with other test strains, 4 location specific fragments were found, 380 bp gene fragment located at 844-1 224 position of 16SrDNA, which was unique ofBrucellaspp. Phylogenetic tree revealed thatBrucellaisolates and standard strains clustered in one terminal branch, and the genetic distance was approximately close to 0. It’s was unable to precise distinct between the relationship, as the evolutionary distance was much closed. TheBrucellaisolates gathered in a one sub-branch withOchrobactrumanthropi, the genetic distance was about 0.019.Brucellaspp. was closely related to theOchrobactrumanthropi. The relative distances with other strains (such asVibriocholerae,Yersiniaenterocolitis bacteria) were greater than 0.02. In conclusion, phylogenetic relationship ofBrucellastrains isolated and standard strains were analyzed from genetic evolution perspectively, the genetic distances of all specific type were close, which hinted that 16SrDNA ofBrucellawas highly conserved sequence and was not suitable as a target gene forBrucellagenetic evolution analysis.BrucellaandOchrobactrumanthropihad closer genetic relationship; 16SrDNA specific 380 bp gene fragment ofBrucellagenus could be used as target sequences for rapid identification ofBrucella.

Brucella; 16S rDNA; genetic evolution; analysis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.003

夏咸柱, Email: xiaxzh@cae.cn; 崔步云, Email: cuibuyun@icdc.cn

1.內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018； 2.烏蘭察布市地方病防治中心，烏蘭察布 012000； 3.中國疾病預防中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206； 4.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,長春 130122

Funded by the Health Scientific Research Project of Health and Family Planing Commission of Inner Mongolia Autonomous Region (No. 201301094)

R378

A

1002-2694(2015)08-0700-04

2014-09-17；

2014-12-26