陳 程,徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院,杭州 310018)

樺褐孔菌子實(shí)體三萜單體的分離及鑒定

陳 程,徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院,杭州 310018)

利用超聲破壁處理,氯仿為溶劑對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體中三萜單體進(jìn)行提取。通過(guò)薄層層析色譜(TLC)檢測(cè),用1%香草醛-濃硫酸試劑作為顯色劑,反復(fù)用硅膠柱色譜對(duì)氯仿提取物進(jìn)行梯度洗脫,得到兩種羊毛脂烷型的三萜化合物,即化合物1(121 mg)和化合物2(67 mg)。采用HPLC的方法在206 nm處分析其純度,同時(shí)紅外光譜(IR)分析兩種化合物的特征,以及核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)技術(shù)對(duì)兩種羊毛脂烷型的三萜化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)比已知標(biāo)準(zhǔn)譜圖,最終確定其結(jié)構(gòu)為羊毛甾醇(Lanosterol)和栓菌酸(Trametenolic acid)。

樺褐孔菌; 硅膠柱色譜法; 三萜化合物; 羊毛甾醇; 栓菌酸

0 引 言

樺褐孔菌在中國(guó)被稱為“樺樹(shù)中的褐色靈芝”,具有許多類似于靈芝的功效。16世紀(jì)以來(lái),這種擔(dān)子類白腐真菌廣泛被俄羅斯和西伯利亞西部地區(qū)的人們當(dāng)作民間用藥,用于治療各種疑難雜癥,如胃癌、肝癌、腸癌等及消化系統(tǒng)疾病[1]。隨著對(duì)樺褐孔菌認(rèn)識(shí)得深入,食品及藥品行業(yè)對(duì)其需求也在不斷增加,樺褐孔菌被譽(yù)為我國(guó)最有發(fā)展前景的23種藥用真菌之一[2]。不少國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)樺褐孔菌的有效成分及其藥理活性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示從樺褐孔菌中分離得到多種具有藥用價(jià)值的有效成分,主要包括多糖(polysaccharides)、多酚(polyphenols)、三萜類成分(triterpenoids)、類固醇(steroids)、黑色素(melain)等[3],還有報(bào)道稱已經(jīng)分離出單寧化合物、生物堿、木質(zhì)素類化合物[4]、鞘氨脂類似物及甘露醇等化學(xué)物質(zhì),這些成分對(duì)治療許多疾病有良好的效果[5]。三萜化合物作為樺褐孔菌的重要成分之一,一直是天然藥物化學(xué)研究的重要領(lǐng)域,也是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物活性成分的來(lái)源,其中四環(huán)三萜類具有抗炎、抗菌、抗癌以及抗血小板聚集等心血管方面的生物活性[6]。近年來(lái),不少國(guó)內(nèi)外學(xué)者從樺褐孔菌中分離得到具有生物活性的三萜化合物,大多以四環(huán)或五環(huán)三萜化合物為主。本研究在此基礎(chǔ)上利用硅膠柱色譜法和TLC法對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體中的羊毛脂烷型三萜化合物進(jìn)行提取、分離及純化,通過(guò)紅外、核磁(1H和13C-NMR)確定其三萜化合物的結(jié)構(gòu)。

1 試 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

樺褐孔菌子實(shí)體購(gòu)于杭州胡慶余堂。

1.1.2 主要試劑

CDCl3(色譜純,阿拉丁試劑公司);氘代二甲基亞砜(色譜純,阿拉丁試劑公司);硅膠(青島海洋化工分廠);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌子實(shí)體的提取

樺褐孔菌子實(shí)體粉碎,過(guò)60目篩,在75℃的干燥箱中干燥6 h。精確稱取樺褐孔菌子實(shí)體粉末180 g,加入適量氯仿,分3批在冰水浴中超聲破壁(破壁1 h,間歇4 s)。合并提取物。在50℃水浴下浸泡7 d[7],之后加熱回流3次,每次回流8 h。合并提取液,減壓濃縮得氯仿提取物為1.61 g。

1.2.2 流動(dòng)相的確定

通過(guò)薄層層析色譜檢測(cè),以1%的香草醛-濃硫酸試劑為顯色劑,確定最佳流動(dòng)相為石油醚∶丙酮,根據(jù)以下公式,

(1)

經(jīng)驗(yàn)值Rf=0.25為上柱的流動(dòng)相比例,結(jié)果確定石油醚∶丙酮為30∶1是第一個(gè)三萜組分的最佳比例,其他組分以此類推。

1.2.3 三萜單體的分離及純化

如圖1所示,氯仿提取物經(jīng)反復(fù)地硅膠柱色譜進(jìn)行濕法上柱,通過(guò)流動(dòng)相為石油醚∶丙酮(50∶1→1∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每50 mL收集1次。當(dāng)石油醚∶丙酮為30∶1時(shí),每10 mL收集1次。1%的香草醛-濃硫酸作為顯色劑,將所收集的溶液用TLC檢測(cè)。根據(jù)Rf值合并相同的流分,單一組分A用甲醇對(duì)其重結(jié)晶,得白色針狀結(jié)晶,過(guò)濾、干燥得化合物1(121 mg);同樣對(duì)單一組分B用氯仿進(jìn)行重結(jié)晶,白色晶體析出,最終獲得化合物2(67 mg)。

圖1 樺褐孔菌子實(shí)體中三萜單體的分離流程

1.2.4 三萜單體的HPLC分析方法

分離得到的化合物1和化合物2,分別配制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.22 μm的微孔濾器過(guò)濾后,在Agilent 1100的高效液相色譜(HPLC)上進(jìn)行梯度洗脫,波長(zhǎng)為206 nm[8]。色譜柱是反相TC-C185 μm 4.6×150 mm (Agilent,Santa Clara,CA,USA),流動(dòng)相是乙腈∶水(90∶10,0 min; 97∶3,10 min),進(jìn)樣量為20 μL,柱溫為30℃。

1.2.5 三萜單體的結(jié)構(gòu)鑒定

分離得到的化合物采用紅外(IR)、1H和13C NMR光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[9-10]。1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)光譜采用標(biāo)準(zhǔn)的脈沖序列,CDCl3作為化合物1的溶劑,而化合物2不溶于CDCl3,選擇DMSO作為溶劑,TMS作為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC的純度分析

化合物1和化合物2的產(chǎn)率分別為0.067%和0.037%,根據(jù)1.2.4的流動(dòng)相比例進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知,化合物1的保留時(shí)間為41.637 min處,僅出現(xiàn)一個(gè)主峰;圖2(b)中發(fā)現(xiàn)化合物2的保留時(shí)間7.488 min,僅有一個(gè)主峰。同時(shí),經(jīng)HPLC分析其純度均達(dá)98%以上。

圖2 化合物1和化合物2的HPLC圖(濃度為250 μg/mL)

2.2 三萜單體的紅外光譜分析

通過(guò)反復(fù)的硅膠柱色譜分離得到兩種羊毛脂烷型的三萜化合物即化合物1和2,其結(jié)構(gòu)如圖3所示,產(chǎn)率分別為0.067%和0.037%。這兩種化合物進(jìn)行IR分析,如圖4所示。

圖3 從野生I.obliquus中分離得到的化合物1和2的結(jié)構(gòu)式

圖4 化合物的IR光譜

由圖4(b)可知,在3 437 cm-1處存在一個(gè)較寬的寬峰,在1 699 cm-1處存在羰基的特征峰，在1 027 cm-1存在游離羧基上的O—H彎曲振動(dòng)的特征峰,同時(shí)在2 938、2 874、1 384、1 455 cm-1和1 699 cm-1處有—CH3和—CH2—的特征峰,在1 637 cm-1處有一個(gè)比較弱的碳碳雙鍵的峰。

2.3 核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.11H-NMR的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1(CDCl3):由圖5可知,在高場(chǎng)區(qū)δ=0.69(s,3H,18-Me),0.98(s,3H,19-Me),1.00(s,3H,28-Me),0.81(s,3H,29-Me),0.87(s,3H,30-Me)分別為C-28,C-18,C-30,C-19,C-29的質(zhì)子峰,這是四環(huán)三萜類化合物的典型特征;0.91(d,3H,21-Me)為C-21上的H與C-20上的H發(fā)生偶合而裂分成二重峰;1.60(s,3H,26-Me),1.68(s,3H,27-Me)分別為C-26和C-27烯丙偶合的寬峰;3.22,3.24(dd,1H,3-CHOH),1.06(m,1H,5-H),1.42(m,1H,20-H),1.47(m,1H,17-H),5.10(t,1H,24-H)為24-C上質(zhì)子峰。

圖5 化合物1的 1H-NMR(CDCl3)分析

化合物2(DMSO):由于化合物2不溶于CDCl3,故采用DMSO做溶劑用于核磁分析,結(jié)果如圖6所示:δ=0.69(s,3H,18-Me),0.97(s,3H,19-Me),0.70(s,3H,28-Me),0.83(s,3H,29-Me),0.91(s,3H,30-Me)是在高場(chǎng)區(qū)四環(huán)三萜的典型特征峰;1.53(s,3H,26-Me),1.63(s,3H,27-Me)為烯丙基偶合形成的寬峰,1.15(m,1H,5-H),1.42(m,1H,17-H),5.07(t,3H,24-Me),12.01(s,1H,20-COOH)為連接羧基的質(zhì)子峰信號(hào),3.21,3.19(dd,1H,3-CHOH)。

圖6 化合物2 1H-NMR(DMSO)分析

2.3.213C-NMR的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1的譜圖見(jiàn)圖7,化學(xué)位移為77.95ppm為C-3信號(hào),化學(xué)位移為133.36、133.36、124.22、129.89ppm分別是化合物烯碳上(C-8,C-9,C-24,C-25)的信號(hào)。其他信號(hào)與羊毛甾醇(Lanosterol)均一致[9-10],詳見(jiàn)表1。

表1 從I.obliquus中分離得到的四種化合物的13C-NMR(100 MHz)

圖7 化合物1的13C-NMR(CDCl3)分析

化合物2的譜圖見(jiàn)圖8,δ79.14 ppm為C-3信號(hào),176.97 ppm為—COOH上的信號(hào),134.26、133.34、123.81、131.09 ppm分別為烯碳上(C-8,C-9,C-24,C-25)的信號(hào)。其他信號(hào)與栓菌酸(trametenolic acid)一致[9-10],詳見(jiàn)表1。

圖8 化合物2 13C-NMR(DMSO)分析

3 結(jié) 論

三萜化合物是樺褐孔菌子實(shí)體中的重要成分之一,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,進(jìn)行三萜化合物所有組分的分離是非常困難的,然而三萜化合物具有明顯的藥理活性,如抗腫瘤、抗突變、抗細(xì)胞增殖等[11-13],因此,從樺褐孔菌子實(shí)體中分離出具有生物活性的三萜化合物具有潛在的應(yīng)用遠(yuǎn)景。本研究通過(guò)硅膠柱色譜和TLC技術(shù)相結(jié)合分離出兩種含量較高的化合物,即化合物1和化合物2,分別用甲醇和氯仿進(jìn)行重結(jié)晶,并建立HPLC的純度分析方法,采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相,得到的峰尖銳且無(wú)拖尾現(xiàn)象;利用IR和核磁共振即1H-NMR和13C-NMR,與已知化合物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比,確定這兩種化合物的結(jié)構(gòu)分別為羊毛甾醇和栓菌酸。反復(fù)地硅膠柱色譜技術(shù)分離重要的三萜成分,為探索更多具有生物活性的三萜化合物提供依據(jù),為研究樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)三萜奠定基礎(chǔ),也為藥物和保健品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供廣闊的前景。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Isolation and Identification of Triterpenoids inInonotusObliquus

CHENCheng,XUXiang-qun

(School of Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)

Triterpenoid compounds inInonotusobliquuswere extracted by using CHCl3as solvent and ultrasonic wall-breaking treatment.The thin-layer chromatography (TLC) was applied.1% vanillin-sulfuric acid reagent served as the color developing agent.Gradient elution was conducted repeatedly for chloroform extracts with silica gel column chromatography to gain two types of lanostane-type triterpenoids,i.e.compound 1 (121 mg) and compound 2 (67 mg).Moreover,HPLC method was applied to analyze the purity of triterpenoids at 206 nm.IR was used to analyze features of the two compounds.Meanwhile,nuclear magnetic resonance (1H-NMR and13C-NMR) technology was used to identify the structures of two lanostane-type triterpenoids.Through comparing the known standard spectrum diagram,the structures were finally confirmed as lanosterol and trametenolic acid.

Inonotusobliquus; silica gel column chromatography; triterpenoids; lanosterol; trametenolic acid

1673-3851 (2015) 02-0264-05

2014-03-17

浙江省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012C23075)

陳 程(1988-),女,浙江紹興人,碩士研究生,主要從事生物技術(shù)與生物化工方面的研究。

徐向群,E-mail:xuxiangqun@zstu.edu.cn

O629

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