鮑思元

(湖北科技學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 湖北 咸寧 437100)

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)

鮑思元

(湖北科技學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 湖北 咸寧 437100)

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位十分重要，但在實(shí)驗(yàn)中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作難度比較大，影響因素比較多，耗時(shí)比較長(zhǎng)。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)相關(guān)操作流程進(jìn)行了研究和探索，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化。改進(jìn)和優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)易、詳細(xì)，試劑配方更合理，成功率得到提高，學(xué)生能在4學(xué)時(shí)內(nèi)完成，為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了基本條件。

聚丙烯酰胺凝膠；電泳；改進(jìn)；優(yōu)化；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種比較普遍的電泳技術(shù)，采用聚丙烯酰胺作為電泳介質(zhì)，是聚合酶鏈反應(yīng)、單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)分析中不可缺少的技術(shù)，多用于單鏈堿基易位、插入或缺失等基因變異情況的篩查，還可以廣泛用于遺傳育種、基因定位、種子活力測(cè)定等方面【1】。

與瓊脂糖凝膠電泳相比，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作復(fù)雜，價(jià)格高，但其分辨率高，能分辨相差幾個(gè)堿基的核酸小片段，結(jié)果可永久保存。從該膠中回收的DNA純度極高，可適用于分子生物學(xué)中較高要求的實(shí)驗(yàn)【2-3】。但是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，常會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，如膠破裂、背景太深、無(wú)DNA帶或帶紋不清晰、影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素等。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中能順利進(jìn)行，我們對(duì)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)相關(guān)操作流程進(jìn)行了研究和探索，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，優(yōu)化了操作流程，使優(yōu)化后的DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)更適合于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在化學(xué)催化劑過(guò)硫酸銨(AP)和加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的作用下形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。凝膠孔徑的大小可通過(guò)控制單體和交聯(lián)劑的比例來(lái)調(diào)節(jié)，從而滿(mǎn)足不同分子量物質(zhì)的分離要求，如表1所示[4]。聚丙烯酰胺凝膠包括非變性聚丙稀酰胺凝膠和變性聚丙烯酰胺凝膠，前者用于分離和純化雙鏈DNA片段，后者用于分離和純化單鏈DNA片段。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及配制

表1 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍

注：1)N，N′-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30。；2)列出的數(shù)字是遷移率與染料相同的雙鏈DNA的粗略大小(核苷酸對(duì))。

2)變性劑。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺95 mL，溴酚藍(lán)0.05 g，二甲苯青0.05 g，加雙蒸水定容至100 mL。

3)固定液。100 mL冰醋酸溶于雙蒸水定容至1 000 mL。

3 DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作流程

3)電泳。安裝電泳裝置，在電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使緩沖液覆蓋樣品孔。拔出樣品梳，用移液器吸取適量緩沖液沖洗樣品孔。打開(kāi)變壓器，恒定功率60 W預(yù)電泳15～30 min。預(yù)電泳結(jié)束后，用移液器將DNA樣品小心注入樣品孔中(加樣量為3～5 μL)，電泳直至帶型分開(kāi)。

4)固定。關(guān)閉電源，卸下玻璃板，剝離玻璃板，將膠板置于固定液中固定30 min, 直到指示劑顏色褪去。

5)漂洗。將膠板轉(zhuǎn)移到雙蒸水中漂洗三遍，每次2～3 min。

6)染色。轉(zhuǎn)移膠板至染色液中，在搖床上搖動(dòng)染色30～40 min。

7)顯影。將膠板在雙蒸水中漂洗5～10 s后立即放入預(yù)冷為4 ℃～10 ℃的顯影液中，搖動(dòng)顯影直到帶型完全出現(xiàn)。

8)定影。將出現(xiàn)帶型的膠板放入固定液中定影2～3 min，再用雙蒸水漂洗兩次(每次2 min)。

9)干膠。膠板置于室溫自然干燥。

10)帶型統(tǒng)計(jì)。

4 實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng)

1)準(zhǔn)備玻板時(shí)，反硅化劑一定要涂勻，否則揭膠時(shí)會(huì)撕破膠塊。

2)配好的丙烯酰胺單體凝膠貯存液用棕色瓶盛裝，置冰箱內(nèi)保存(可放1～2個(gè)月)；如有不溶物應(yīng)過(guò)濾。

4)制膠時(shí)對(duì)過(guò)硫酸銨的量要適當(dāng)把握，防止出現(xiàn)膠不凝固或凝固過(guò)快而來(lái)不及灌膠的現(xiàn)象。

5)膠制備完成后立即灌膠。因?yàn)榧尤隩EMED和過(guò)硫酸銨后，膠即刻反應(yīng)，若不及時(shí)灌膠則會(huì)導(dǎo)致凝膠凝固不均勻，電泳后得到的條帶形狀不規(guī)則。灌膠完畢后要立即插入樣品梳，否則凝膠凝固再插樣品梳則會(huì)毀膠。拔樣品梳時(shí)應(yīng)垂直向上，均勻用力，緩慢拔出，否則會(huì)導(dǎo)致樣品槽損毀?？傊裟z制備出現(xiàn)問(wèn)題則直接導(dǎo)致電泳條帶不清晰、變形、拖尾等，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6)制凝膠時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。因?yàn)闅馀輹?huì)影響電泳分離效果。

7)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，操作時(shí)應(yīng)避免沾在臉、手等皮膚上，最好戴一次性塑料手套操作。凝膠倒完以后剩余的膠液一定要等待其凝固后，才能挑出來(lái)丟棄，避免對(duì)環(huán)境造成污染。因?yàn)槟z充分交聯(lián)以后沒(méi)有毒性。

8)顯影時(shí)在水里漂洗時(shí)間為5～10 s，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使帶型的信號(hào)微弱。顯影液溫度不要過(guò)高，否則會(huì)使背景變深。

5 實(shí)驗(yàn)操作的調(diào)控與優(yōu)化

5.1 滲樣的問(wèn)題

在點(diǎn)樣時(shí)，常常出現(xiàn)一個(gè)點(diǎn)樣孔的樣品滲透到鄰近的點(diǎn)樣孔里，這樣跑出的帶型就不能正確反應(yīng)該點(diǎn)樣孔里的信息，造成實(shí)驗(yàn)的失敗。文中從三個(gè)方面探討如何避免滲樣的問(wèn)題：(1)在制膠時(shí)，插完樣品梳后，用夾子夾住常出現(xiàn)滲樣的一端，減少玻板之間的距離；(2)在點(diǎn)樣時(shí)，用小夾子夾住常出現(xiàn)滲樣的一端，使梳子與玻板貼近；(3)當(dāng)點(diǎn)的樣品較多而點(diǎn)樣速度又慢時(shí)，可以分段點(diǎn)樣，即點(diǎn)完若干樣品后，讓其先跑5～10 min，再點(diǎn)另一段樣。

5.2 電泳時(shí)間

在跑膠時(shí)，電泳時(shí)間至關(guān)重要。比如,在做水稻SSR分析時(shí)，有些SSR等位基因之間的差別較大，只要跑1 h的時(shí)間就足以看出多態(tài)性。電泳時(shí)間長(zhǎng)了，帶型反而變?nèi)?，影響讀膠。而有些SSR等位基因之間的差別較小，電泳時(shí)間短了，帶沒(méi)有跑出來(lái)，就需要增長(zhǎng)電泳時(shí)間，直到樣品的遺傳信息充分反應(yīng)出來(lái)。

5.3 點(diǎn)樣道數(shù)

同一對(duì)引物組合在親本間等位基因差異較小且非特異擴(kuò)增帶較少時(shí)，可使用多次點(diǎn)樣技術(shù)提高實(shí)驗(yàn)的成功率，即在同一塊膠上點(diǎn)樣2～4次，由此可以適當(dāng)降低成本，提高效率。

6 討論

聚丙烯酰胺凝膠電泳屬于凝膠電泳的一種。聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)用性最強(qiáng)，凝膠機(jī)械性能好、有彈性、透明、化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定、對(duì)pH和溫度變化不敏感、為非離子型、沒(méi)有吸附和電滲作用等，尤為突出的是實(shí)驗(yàn)中所需樣品量小(1～100 μg)，而分辨率又高。因此廣泛應(yīng)用于許多學(xué)科中，在樣品的分離、純度鑒定、多態(tài)性分析、分子量測(cè)定中，是一個(gè)很有價(jià)值、有時(shí)甚至是不可缺少的技術(shù)。但在實(shí)驗(yàn)操作中，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作難度比較大，影響因素比較多，經(jīng)過(guò)本研究的改進(jìn)和優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)操作趨于簡(jiǎn)易、詳細(xì)，試劑配方更合理，成功率得到提高，學(xué)生能在4學(xué)時(shí)內(nèi)完成，為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了基本條件。

聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的耗時(shí)相當(dāng)長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)上要靈活安排時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)課前，要求學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行預(yù)習(xí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟要充分熟悉。學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，教師要對(duì)實(shí)驗(yàn)課的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)籌安排，首先，將實(shí)驗(yàn)的操作流程講解給學(xué)生，要注意每一個(gè)細(xì)節(jié)，教師最好要親手示范關(guān)鍵步驟；然后，學(xué)生按照要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，教師在關(guān)鍵步驟要進(jìn)行提醒和指導(dǎo)。在耗時(shí)較長(zhǎng)的電泳過(guò)程中，教師再進(jìn)一步仔細(xì)講解聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和相關(guān)知識(shí)，也可以介紹一些科研方面的研究成果，便于學(xué)生對(duì)知識(shí)的理解和掌握，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。只有這樣，才能培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力、科研能力、創(chuàng)新能力。

在現(xiàn)代生物技術(shù)中，很多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝膠電泳，如基因定位、基因克隆、轉(zhuǎn)基因等。我們可以嘗試將科研實(shí)驗(yàn)和教學(xué)實(shí)驗(yàn)緊密結(jié)合和有機(jī)轉(zhuǎn)化，將科研成果快速轉(zhuǎn)化到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，使學(xué)生能及時(shí)了解最新的科研動(dòng)態(tài)和研究成果，拓寬學(xué)生的專(zhuān)業(yè)視野，構(gòu)建全面、系統(tǒng)、前沿、創(chuàng)新的教學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

7 結(jié)束語(yǔ)

DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在分子生物學(xué)科研中是一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，許多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝膠電泳。但在實(shí)驗(yàn)中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作難度比較大，影響因素比較多，耗時(shí)比較長(zhǎng)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作技能比較弱的大學(xué)生來(lái)說(shuō)，很難開(kāi)展此類(lèi)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。為了使DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳適合于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，本研究對(duì)DNA變性聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)相關(guān)操作流程進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，對(duì)學(xué)生操作注意點(diǎn)和教師講授注意點(diǎn)作了詳細(xì)的論述。改進(jìn)和優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)操作趨于簡(jiǎn)易、詳細(xì)，學(xué)生能在4學(xué)時(shí)內(nèi)完成。學(xué)生通過(guò)DNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)可以接觸到科研前沿，可以培養(yǎng)動(dòng)手能力、分析與解決問(wèn)題的能力、創(chuàng)新能力。

[1]李其松，王金玉，沈華，等. DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染方法的探討[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(10)：79-80.

[2]Promega.Protocols and applications guide[M].3rd.USA:Promega Corporation，1996:156.

[3]李宏業(yè)，范樹(shù)國(guó)，劉玉樂(lè)，等.改良聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)DNA[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1999，21(4)：201-203.

[4]薩姆布魯克 J,拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]．3版．黃培堂，譯．北京：科學(xué)出版社，2002：419.

Improvement of DNA Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis in Experiment Teaching

BAO Siyuan

(College of Basic Medical, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China)

Status of DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is very important in modern biological technology, but polyacrylamide gel electrophoresis operation is difficult, affected by many factors, time-consuming. In order to make the DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis adapt to experimental teaching, the vertical polyacrylamide electrophoresis technology related operation process is researched, and the experiment is improved and optimized. The improved and optimized experimental operation tends to be convenient, detailed, high success rate, less time-consuming, and reagent formula is more reasonable, which provide a basic condition for experimental teaching.

polyacrylamide gel; electrophoresis; improvement; optimization;experiment teaching

2014-07-07；修改日期: 2014-03-12

鮑思元(1976-)，男，碩士，講師，研究方向：植物分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)。

G642.0；Q94-33

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2015.02.040