李 奎,李雪玲

(安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院,安徽合肥 230036)

響應面法優(yōu)化堿液提取百蕊草多糖的工藝研究

李 奎,李雪玲*

(安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院,安徽合肥 230036)

為了提高百蕊草的利用價值和經濟價值,以百蕊草為原料,在單因素實驗的基礎上,采用了響應面法對堿液提取百蕊草多糖工藝進行了優(yōu)化。結果表明,堿液提取百蕊草多糖的最佳工藝條件為:提取時間2h,提取溫度95℃,料液比1∶33,氫氧化鈉濃度為0.74mol/L。在此條件下,百蕊草多糖的得率為20.86%,與預測值20.66%擬合性較好。

響應面,堿液提取,百蕊草,多糖

百蕊草是檀香科植物,多生長于田野及山區(qū)沙地邊緣中,我國南北各地均有分布。百蕊草具有抑菌、鎮(zhèn)咳、消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等多種生物活性[1-2],是一種廣譜的抗菌中草藥。近年來國內外關于百蕊草的研究重點大多集中在其生物學特性、抑菌成分的提取與性質研究及其開發(fā)利用等幾個方面[3-4],而有關百蕊草多糖的提取分離工藝方面的研究卻鮮見報道。多糖的提取方法有熱水提取法、堿液提取法、超聲波提取法、酶解法提取法等,堿液提取操作簡單而且多糖得率高,是多糖提取較常用的方法之一。因此,優(yōu)化百蕊草多糖的堿液提取工藝,將百蕊草中的多糖提取出來并添加到食品藥品中,將大大提高百蕊草的利用價值和經濟價值。

響應面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是利用合理的實驗設計,采用多元二次方程來擬合因素與響應值之間的函數關系,通過對回歸方程的分析來確定最優(yōu)工藝的一種分析方法[5]。RSM現已廣泛的運用于農業(yè)、醫(yī)藥、食品、化學等多個領域,在食品領域主要用于發(fā)酵工藝和提取工藝的優(yōu)化[6-7]。本文擬在單因素實驗的基礎上,利用響應面分析法對百蕊草多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百蕊草 購于合肥市安徽中醫(yī)學院,經高速中藥粉碎機粉碎后,過40目篩;95%乙醇、重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉等 均為國產分析純。

DD-04四兩裝高速中藥粉碎機 溫嶺市大海藥材器械廠;GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司;752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 百蕊草的前處理 將百蕊草置于15倍體積石油醚中浸泡24h脫脂,再用10倍體積95%乙醇浸泡過夜去黃酮,最后置于烘箱中80℃烘干,將烘干后的百蕊草粉碎后過40目篩,得到百蕊草粉末備用。

1.2.2 多糖含量的測定 文章采用苯酚硫酸法測定多糖含量[8]。

1.2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖50mg,用蒸餾水溶解并定容到50mL,作為儲備液待用。精密量取葡萄糖儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分別置于50mL容量瓶中并定容,搖勻。分別量取上述各溶液2mL,各加入6%苯酚1.0mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0mL,迅速搖勻,放置5min后置沸水浴加熱15min取出,冷水迅速冷卻至室溫;精密量取蒸餾水2.0mL,同樣操作,作為空白對照,按分光光度計法在490nm波長處測定吸光度,測定三次,取其平均值。以吸光值(A)對濃度(C)作回歸計算,繪制標準曲線。

1.2.2.2 堿液提取百蕊草多糖的工藝流程 百蕊草粉末→堿液提取→離心取上清液→旋轉蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀多糖(三倍體積的95%乙醇浸泡過夜)→離心取沉淀→溶解、流水透析48h→冷凍干燥→百蕊草粗多糖。

1.2.2.3 百蕊草多糖含量計算 C=(A-0.0198)/11.894×B×F

式中:C-樣品濃度(mg/mL);A-樣品的吸光值;B-稀釋倍數;F-換算因子(F=2.2889)[9]。

1.2.2.4 百蕊草多糖得率計算 百蕊草多糖得率(%)=(C×V/樣品質量)×100

式中:C-樣品濃度(mg/mL);V-提取液體積(mL)。

1.2.3 單因素實驗 準確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,考察料液比、提取溫度、提取時間、氫氧化鈉濃度對百蕊草多糖得率的影響。

1.2.3.1 料液比對百蕊草多糖得率的影響 準確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,提取溫度80℃,料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40g/mL的條件下提取百蕊草多糖,測定多糖的得率。

1.2.3.2 提取溫度對百蕊草多糖得率的影響 準確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,料液比為1∶30g/mL,提取溫度分別為60、70、80、90、100℃的條件下提取百蕊草多糖,測定多糖的得率。

1.2.3.3 提取時間對百蕊草多糖得率的影響 準確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,料液比為1∶30g/mL,提取溫度80℃,提取時間分別為1、1.5、2、2.5、3h的條件下提取百蕊草多糖,測定多糖的得率。

1.2.3.4 氫氧化鈉濃度對百蕊草多糖得率的影響 準確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,提取時間1.5h,料液比為1∶30g/mL,提取溫度80℃,氫氧化鈉濃度分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L的條件下提取百蕊草多糖,測定多糖的得率。

1.2.4 響應面分析 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,以料液比、提取溫度、提取時間、氫氧化鈉濃度為自變量,百蕊草多糖的得率為響應值,利用響應面分析法優(yōu)化堿液提取百蕊草多糖的工藝條件。響應面因素和水平選取見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表

1.2.5 數據統(tǒng)計分析 將得到的實驗結果利用Excel、Design-Expert 8.0進行直觀分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖的標準曲線

由圖1可以看出,在測定范圍內,葡萄糖濃度和吸光值之間呈良好線性關系,線性方程為y=11.894x+0.0198,相關系數R2=0.9956。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對百蕊草多糖得率的影響 對于提取工藝來說,料液比是考察的重點[10-11]。過低的料液比會導致浸提液與樣品接觸不徹底使多糖不能完全溶出,過高的料液比會造成浪費而且給下一步的分離純化帶來麻煩。從圖2可以看出料液比增加到1∶30g/mL后多糖的得率沒有太大的變化,因此最佳料液比選擇1∶30g/mL。

圖2 料液比對得率的影響Fig.2 The effect of different ratio of alkaline liquor to raw material on the yields

2.2.2 提取溫度對百蕊草多糖得率的影響 從圖3可以看出,隨著溫度的升高,百蕊草多糖得率的變化也呈現先迅速增加后逐漸減緩的趨勢。這可能是因為在過高的溫度條件下,堿性溶液中的多糖易發(fā)生分解和碳鏈斷裂,故最佳溫度選擇90℃。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 The effect of different extraction temperature on the yields

2.2.3 提取時間對百蕊草多糖得率的影響 從圖4可以看出,多糖得率在提取時間2h達到最高值,然后隨著進一步延長提取時間得率迅速下降。這說明多糖溶于提取液是一個緩慢的過程,時間過短,多糖提取不徹底;而時間過長會引起多糖結構的破壞,導致得率降低。因此最佳提取時間為2h。

圖4 提取時間對得率的影響Fig.4 The effect of different extraction time on the yields

2.2.4 氫氧化鈉濃度對百蕊草多糖得率的影響 從圖5可以看出,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L是轉折點。當氫氧化鈉濃度大于0.7mol/L后,百蕊草多糖的得率迅速降低。堿液浸泡能解除細胞壁聚合物之間的物理作用,有助于多糖從細胞內溶出,從而提高多糖得率。但過高的堿液濃度會發(fā)生β-消去反應,引起多糖結構的破壞,多糖得率也隨之降低[12]。

圖5 氫氧化鈉濃度對得率的影響Fig.5 The effect of different NaOH concentration on the yields

2.3 響應面優(yōu)化分析

Box-Benhnken實驗設計及結果見表2,通過軟件進行非線性回歸的二次多項式的擬合,得出二次回歸方程如下:

Y=-294.43208+0.79207A+2.97038B+70.64933C+240.34833D-0.0059AB+0.34AC+2.325AD-0.163BC-0.1425BD+2.6CD-0.040423A2-0.012281B2-16.81733C2-207.93333D2。

由表3可以看出,模型的p值<0.0001,說明該模型顯著,失擬項p值為0.6167>0.05不顯著。該模型的相關系數R2為93.18%,調整后為86.37%,說明該模型能解釋86.37%的響應值的變化[13],證明該模型與實際的擬合性較好。

表2 Box-Benhnken實驗設計及結果

方差分析可知,提取時間對得率的影響不顯著,料液比對得率的影響顯著,提取溫度和氫氧化鈉濃度對得率的影響極顯著;料液比與氫氧化鈉濃度之間交互作用顯著,其余各因素之間的交互作用均不顯著;料液比的二次項對得率的影響顯著,提取溫度、提取時間、氫氧化鈉濃度三者的二次項對得率的影響極顯著。由此可以看出,各因素對得率的影響不是簡單的線性關系。

各因素的F值表示各因素對響應值的影響程度,F值越大表示該因素對響應值的影響越大[14]。從表3可以看出各因素對得率的影響大小排列分別為提取溫度>氫氧化鈉濃度>料液比>提取時間。

表3 回歸方程方差分析表

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(0.01

由回歸方程得出擬合的料液比與氫氧化鈉濃度對得率的影響的響應面圖見圖6。圖6表示了當提取溫度和提取時間為零水平時,料液比和氫氧化鈉濃度對百蕊草多糖得率的影響。響應曲面的陡峭程度反映了因素對響應值的影響力大小,也表明了因素間交互作用的強弱。由圖6可知,料液比與氫氧化鈉濃度之間的交互作用顯著。

圖6 料液比與氫氧化鈉濃度的響應面立體圖Fig.6 Response surface plot showing the effects off the material ratio and NaOH concentration on dried osmund dietary fiber alkaline hydrolysis

2.4 最佳工藝條件的預測和驗證

根據該模型預測出理論條件下堿液提取百蕊草多糖的最佳工藝條件為:料液比1∶32.66g/mL,提取溫度95.35℃,提取時間2.03h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,百蕊草多糖的得率為20.66%?？紤]到實際生產操作,將最優(yōu)工藝條件修正為:料液比1∶33g/mL,提取溫度95℃,提取時間2h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,經驗證此條件下百蕊草多糖的實際得率20.86%,與預測值的相對偏差小于1%。因此,基于響應面法得到的優(yōu)化提取工藝參數準確可靠,有實用價值。

3 結論

文章在單因素實驗的基礎上,通過響應面實驗設計對堿液提取百蕊草多糖的工藝進行了優(yōu)化,結果表明料液比、提取溫度、提取時間、氫氧化鈉濃度四個因素對百蕊草多糖得率的影響大小為:提取溫度>氫氧化鈉濃度>料液比>提取時間,最佳工藝條件為料液比1∶33g/mL,提取溫度95℃,提取時間2h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,此條件下百蕊草多糖的得率高達20.86%。本研究為百蕊草的開發(fā)利用提供了科學依據,具有重要的現實意義。

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Study on response surface methodology for alkali extraction of polysaccharide from thesium

LI Kui,LI Xue-ling*

(College of Tea and Food Science and Technology,Anhui Agriculture University,Hefei 230036,China)

In order to improve the use value and economic value of Thesium,Thesium was used as raw materials.Based on the single factor experiment,the alkali extraction process of polysaccharide Thesium were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were:extraction time 2h,extraction temperature 95℃,solid-liquid ratio 1∶33,the concentration of sodium hydroxide for 0.74mol/L. Under this condition,Thesium polysaccharide yield was 20.86%,which fits well with the predicted value 20.66% .

response surface;alkaline liquor extraction;thesium;polysaccharides

2014-07-10

李奎(1991-),男,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全。

*通訊作者:李雪玲(1972-),女,碩士，副教授,研究方向:食品營養(yǎng)與質量安全。

TS211.9

B

1002-0306(2015)07-0204-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.035