王丹丹,周晨妍,李同彪,張振群,王亞杰,梁真真,張 青,路丹榮

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院,河南新鄉(xiāng)453003)

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在畢赤酵母中的高效表達

王丹丹1,2,周晨妍1,*,李同彪1,張振群1,王亞杰1,梁真真1,張 青1,路丹榮1

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院,河南新鄉(xiāng)453003)

將黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2(成熟肽堿基)插入表達載體pPIC9K中,SalⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)MD平板、G418梯度和搖瓶復篩篩選出多克隆陽性轉(zhuǎn)化子。選擇28h的種子,每隔24h補加1.5%的甲醇,發(fā)酵96h后,比酶活可達13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,該蛋白相對分子質(zhì)量為23.0ku;重組酶最適作用溫度為45℃,最適作用pH為5.0,在溫度35～40℃、pH5～7條件下有良好的穩(wěn)定性,Ca2+對酶的激活作用最明顯。

黑曲霉,木聚糖酶,畢赤酵母GS115,誘導表達

木聚糖酶(Xylanase)[EC3.2.1.8]是指將木聚糖降解為低聚糖和木糖的一類酶的總稱,是木聚糖降解酶系中最為關鍵的酶[1-3]。近年來該酶在食品、能源、飼料、造紙工業(yè)及環(huán)境等領域均有了廣泛的應用,具有很高的經(jīng)濟價值。產(chǎn)木聚糖酶的微生物分布很廣,包括放線菌、真菌、細菌和一些酵母等[4-6]。不同種類,不同來源的木聚糖酶顯示出不同的催化特性,使用各種手段來提高該酶的產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本,挖掘出其潛力并應用到實際生產(chǎn)中去是亟待解決的問題。

在前期的實驗中我們已經(jīng)從黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因xynZF-2,并且在大腸桿菌中進行了可溶性表達,但是表達量不高并且為胞內(nèi)表達[7]。本研究在此基礎上將xynZF-2克隆到真核表達載體上并在畢赤酵母中進行分泌表達,并對其所產(chǎn)重組木聚糖酶的酶學性質(zhì)進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-28a-xynZF-2重組載體 新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院酶與發(fā)酵工程實驗室構建保存;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115、表達質(zhì)粒pPIC9K 均購自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4DNA連接酶、SalⅠ酶 均購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒 均購自上海生工生物有限公司;樺木木聚糖(Birch wood xylan) 購自Sigma公司;無氨基酸酵母氮源(YNB)、G418 購自Amresco公司;其他生化試劑 均為進口或國產(chǎn)分析純;LB、YPD、MD、BMGY(富集培養(yǎng)基)、BMMY(誘導培養(yǎng)基)配制方法見參考文獻[8]。

HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;梯度PCR擴增儀 C1000 Bio-Rad Laboratory;DC-0506低溫恒溫槽() 上海比朗儀器有限公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-2) 北京市六一儀器廠;高速冷凍離心機(Neofuge 23R) 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設計及合成 根據(jù)xynZF-2基因的序列以及表達載體pPIC9K上多克隆位點的特征,設計并合成以下一對引物:P1:5′-CCGGAATTC GTTCCCCACGACTCTGTCG-3′(EcoRⅠ);P2:5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTG AACAGTGATGGA-3′(NotⅠ)。

1.2.2 畢赤酵母重組表達載體的構建 PCR擴增得到的木聚糖酶基因xynZF-2,經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化,并與表達載體pPIC9K同時用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切?；厥詹⒓兓p酶切后的xynZF-2基因和pPIC9K載體片段,經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,用含卡那霉素LB平板篩選陽性克隆子。提取質(zhì)粒后,用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切并通過測序來驗證插入基因片段是否正確,最后得到pPIC9K-xynZF-2。

1.2.3 重組畢赤酵母的構建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選 用SalⅠ酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-xynZF-2以及對照空載體pPIC9K,瓊脂糖凝膠回收純化目的片段并分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中,電擊轉(zhuǎn)化方法參照Invitrogen公司操作手冊。利用MD平板篩選出陽性克隆子,并在含有不同G418濃度的(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0、8.0mg/mL)的YPD培養(yǎng)基平板上進行高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選,最后搖瓶復篩得到一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株(編號65#)。

1.2.4 重組畢赤酵母工程菌株的搖瓶培養(yǎng)及誘導表達 挑取編號為65#的菌株,接種于含有20mL BMGY培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中,30℃,250r/min培養(yǎng)至A600為6.0左右,離心收集菌體,轉(zhuǎn)接至裝有20mL BMMY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),每24h補加100%甲醇至終濃度為0.5%,誘導表達3～5d。

1.2.5 表達產(chǎn)物的純化和SDS-PAGE分析 重組轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-xynZF-2誘導培養(yǎng)96h,3000r/min離心10min,取發(fā)酵上清液聚乙二醇濃縮,透析純化后進行12% SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色,檢測目的蛋白的表達。

1.2.6 木聚糖比酶活的測定 采用改進的DNS法[9]測定木聚糖酶活力。酶活單位的定義:在50℃和pH4.6條件下,以0.5%樺木木聚糖作為底物,以每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量為1個酶活單位。

用Bradford法[10]測定蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

酶的比活(U/mg)=酶活性/蛋白濃度。

1.2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化 將種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)1%接種量接種于30mL生長培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)全部轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基BMMY中,同時按體積分數(shù)0.5%添加甲醇,并每隔24h補加甲醇一次,在30℃的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為240r/min,分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基接種時間、甲醇誘導濃度、誘導時間等因素進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.8 酶學性質(zhì)的測定 酶的最適作用溫度和pH以及熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的具體實驗操作方法見參考文獻[7],反應所用緩沖液濃度分別為0.05mol/mL的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0),Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0),磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0～7.0)和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH3.0～5.0)。

金屬離子對酶活性的影響:將酶在最適的pH體系下40℃保溫1h,然后進行最終濃度為1mmol/L化合物和金屬離子對酶活性影響的實驗。以標準方法測定酶活力,以不加金屬離子的酶活性為100%,計算相對酶活。

1.2.9 酶學動力學參數(shù)測定 在酶促反應的最適條件下,以0.5%樺木木聚糖為底物,依次在酶促反應的2、4、6、8、10、15、20、25、30min時終止反應,測定木聚糖酶活性,計算出酶促反應的一級反應時間,確定測定Km值及Vmax的反應時間為20min。以濃度分別為1～10mg/mL的樺木木聚糖為底物,在最適條件下測定酶活活性,計算出相應的反應速度,并利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值及Vmax。

1.2.10 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)均用Excel辦公軟件和SPSS11.0軟件進行處理,并繪制出相應的變化曲線。

2 結果與分析

2.1 畢赤酵母重組表達載體的構建

以pET-28a-xynZF-2為模板,以P1/P2為引物進行PCR擴增得到xynZF-2基因(圖1)。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR product注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR擴增產(chǎn)物

將xynZF-2以正確的閱讀框架插入到酵母表達載體pPIC9K的α-因子信號肽的下游,得到重組表達載體pPIC9K-xynZF-2。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定(圖2),并測序正確后確定重組質(zhì)粒構建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-xynZF-2的雙酶切驗證Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR擴增產(chǎn)物;2:EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pPIC9K-xynZF-2。

2.2 重組畢赤酵母的構建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達載體pPIC9K-xynZF-2經(jīng)SalⅠ線性化以后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細胞GS115中,將轉(zhuǎn)化液體涂布MD平板篩選出陽性克隆子。另外,表達載體pPIC9K上含有卡那霉素G418藥物的抗性基因,并且相關研究認為G418抗性與重組轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)呈正相關關系。因此,可以直接用含有高濃度G418的YPD快捷方便的篩選出含重組載體pPIC9K-xynZF-2多拷貝的重組菌株。

將在MD平板上篩選的陽性轉(zhuǎn)化子在含有不同濃度G418的YPD平板上進一步篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子,最終在8.00mg/mL G418的YPD平板上篩選得到四十多個高拷貝轉(zhuǎn)化子。搖瓶復篩,得到一株高產(chǎn)木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株(PichiapastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#)。

2.3 重組蛋白的誘導表達和條件優(yōu)化

2.3.1 接種時間的優(yōu)化 將P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#進行甲醇誘導表達,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。在發(fā)酵過程中,種子的選擇非常關鍵,種齡太短,發(fā)酵過程會出現(xiàn)前期生長緩慢,致使周期延長,甚至造成異常發(fā)酵;種齡過長,會引起菌體過早自溶,導致生產(chǎn)能力下降。圖3結果顯示接種時間選擇在對數(shù)生長期的28h(A600=16.0)時,比酶活最高。

圖3 接種時間對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculation time on xylanase production

2.3.2 甲醇誘導時間的優(yōu)化 圖4結果表明,誘導表達前期隨著時間的延長,表達量增大,在誘導96h時達到最大,接著隨著時間的進一步增加,產(chǎn)酶量依次遞減。

圖4 甲醇誘導時間對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of induction time on xylanase production

2.3.3 甲醇誘導濃度的優(yōu)化 甲醇能夠誘導重組畢赤酵母表達,但是并不是隨著甲醇濃度的增加表達量就隨之增加,圖5結果表明,甲醇濃度在1.5%時誘導表達量最大,濃度過大對誘導表達反而起抑制作用。

圖5 甲醇濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of methanol concentration on xylanase production

2.4 重組木聚糖酶的SDS-PAGE

將P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#誘導表達發(fā)酵液上清與上樣緩沖液煮沸10min后3000r/min離心5min,然后SDS-PAGE電泳,結果(圖6)顯示,重組菌株在23.0ku左右處有一明顯條帶,并且大小與預測蛋白分子量相符,除目的蛋白外,基本上無雜帶,能夠滿足后期酶學性質(zhì)分析。

圖6 重組表達木聚糖酶SDS-PAGE分析Fig.6 Analysis of recombinant expressed xylanase by SDS-PAGE注:M:蛋白分子量標準;1:GS115/pPIC9K-xynZF-2 65#誘導純化。

2.5 重組木聚糖酶酶學性質(zhì)

2.5.1 重組木聚糖酶最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性 由圖7可以看出,該重組木聚糖酶作用最適溫度為45℃,溫度過高或者過低對重組酶活性都有不同程度的影響。圖8結果顯示,重組酶在35℃和40℃條件下穩(wěn)定性良好,在此溫度下保溫1h以后相對酶活性仍然能夠保持在70%以上;隨著溫度的升高,重組酶的穩(wěn)定性越來越差,45℃和50℃條件下保溫30min以后,相對酶活性降到10%以下,說明該重組酶的耐熱性不好,有待進一步提高。

圖7 溫度對重組木聚糖酶酶活性的影響Fig.7 The effect of temperature on xylanase activity

圖8 重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.8 The thermostability of the xylanase

2.5.2 重組木聚糖酶最適作用pH和pH穩(wěn)定性 圖9結果顯示該重組酶的最適作用pH為5.0,作用環(huán)境偏酸,過酸或者偏堿對酶活性都有強烈的抑制作用。將該重組酶在不同的pH條件下保溫1h以后,在pH5.0～7.0之間,相對酶活性仍然能夠保持在60%以上,過酸或者偏堿都有可能影響重組酶蛋白質(zhì)分子的構象,進而來影響酶的活性,相對酶活性降到30%以下。

圖9 pH對重組酶活性的影響及重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.9 The effect of pH on activity and stability of the recombinant xylanase

2.5.3 金屬離子對酶活性的影響 將重組木聚糖酶與不同的金屬離子保溫一段時間以后,酶活性均有不同程度的改變,圖10結果顯示,Zn2+、Ca2+、Fe2+、EDTA對該重組酶有不同程度的激活作用,其中Ca2+激活作用最強,其余常見離子對重組酶活性有不同程度的抑制作用,尤其是與Cu2+保溫之后,相對酶活性僅僅保留在50%左右,與原核細胞中表達的酶性質(zhì)大有不同[7],其機制有待進一步研究。

圖10 金屬離子對重組酶活性的影響Fig.10 The effect of metal ions on recombinant xylanase

2.6 重組酶酶學動力學參數(shù)測定

在酶促反應的最適條件下,以0.5%樺木木聚糖為底物,依次在酶促反應的2、4、6、8、10、15、20、25、30min時終止反應,測定木聚糖酶活性,計算出酶促反應的一級反應時間,確定測定Km值及Vmax的反應時間為20min。以濃度分別為1～10mg/mL的樺木木聚糖為底物,在最適條件下測定酶活活性,計算出相應的反應速度,并利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值及Vmax。該重組木聚糖酶的動力學參數(shù)的測定結果為Vmax=2500μmol/mL/min,Km=1.5mg/L。

3 討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來國內(nèi)外公認的最有效的新型外源蛋白表達系統(tǒng)之一,該表達系統(tǒng)具有高效表達、高穩(wěn)定性、高效分泌、高密度發(fā)酵以及很容易被用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點,已有多種外源蛋白在畢赤酵母中獲得了成功的表達[11-14]。

本研究將從黑曲霉XZ-3S中克隆得到的木聚糖酶基因xynZF-2插入到真核表達載體pPIC9K上,在α-因子分泌信號的下游,利用AOX1高效啟動子的作用使目的基因在畢赤酵母中得到了高效的外分泌表達?？股谿418篩選得到高拷貝轉(zhuǎn)化子以后,對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得到重組菌P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#并且表達木聚糖酶產(chǎn)量可達13210U/mg,遠遠高于原始出發(fā)菌株和大腸桿菌原核表達菌株。該菌株表達的目的蛋白具有很好的生物學活性,為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的出發(fā)菌株,在后續(xù)實驗中需要對該菌株在發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)。

酶學性質(zhì)研究結果表明,該重組木聚糖酶的最適作用溫度為45℃,較大腸桿菌原核表達稍有一定的提高;最適的作用pH為5.0,與原核表達相比差別不大;在溫度35～40℃、pH5～7條件下穩(wěn)定性良好,在保溫1h以后酶活仍能保留在60%以上,熱穩(wěn)定性和耐酸性比原核表達均有了一定程度的提高;Ca2+對該酶的作用有很強的促進作用,Cu2+抑制作用最強,大腸桿菌表達過程中Fe3+激活作用最明顯,二者差別的機制有待進一步研究[7]。木聚糖酶在飼料、漂白等行業(yè)應用廣泛,但是在這些行業(yè)的應用過程中對溫度和pH等環(huán)境都有不同嚴格要求,該重組酶在畢赤酵母中表達良好,但是此酶的最適作用pH環(huán)境偏酸,并且耐熱性不好,離工業(yè)化生產(chǎn)使用仍然有一定的差距[4,15]。故下一步的工作將對該重組酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性進行改造來擴大該重組木聚糖酶的應用范圍,為其工業(yè)化應用開發(fā)奠定良好的基礎。

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Efficient expression of the xylanase genexynZF-2 fromAspergillusnigerXZ-3S inPichiapastoris

WANG Dan-dan1,2,ZHOU Chen-yan1,*,LI Tong-biao1,ZHANG Zhen-qun1,WANG Ya-jie1,LIANG Zhen-zhen1,ZHANG Qing1,LU Dan-rong1

(1. School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China;2. San Quan Medlcal College,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

In this study,a recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2was constructed by inserting genexynZF-2 mature peptide)fromAspergillusnigerintoPichiapastorissecretary vector pPIC9K. The pPIC9K-xynZF-2 linearized bySalⅠwas transformed intoPichiapastorisGS115 by electroporation. The positive recombinant strain was identified by MD medium,G418 and shake bottle selection. The SDS-PAGE analysis showed that the protein molecular weight was about 23.0ku. Under the condition of the vaccination time 28h,1.5% methanol every 24h added,and the methanol induced time 96h,the enzyme production can be achieved 13210U/mg. The optimal temperature and pH of the enzyme activity was 45℃ and 5.0,respectively. The enzyme activity was stable at the conditions of temperature 35～40℃ and pH 5～7. Ca2+had an active effect on the enzyme obviously.

Aspergillusniger;xylanase;PichiapastorisGS115;induction expression

2014-05-19

王丹丹(1988-)，女，碩士，助教，主要從事微生物酶工程研究。

*通訊作者:周晨妍(1979-)，女，博士，副教授，主要從事微生物酶工程研究。

河南省教育廳自然科學研究計劃項目資助(2011A180026)；河南省教育廳科學技術研究重點項目(13A180861)；河南省科技廳科技攻關項目(112102210299)；河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學院科研項目培育基金(2013ZD113)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.034