何春鵬 管 銳 田 田 陸祖宏

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,南京210096)(東南大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210096)

文昌魚(yú)內(nèi)胚層發(fā)育相關(guān)核心調(diào)控基因的表達(dá)

何春鵬 管 銳 田 田 陸祖宏

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,南京210096)(東南大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210096)

研究了脊椎動(dòng)物內(nèi)胚層發(fā)育的核心調(diào)控基因Sox2,Pdx1和Cdx1在文昌魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)形式．結(jié)果顯示:與脊椎動(dòng)物相比,Sox2基因在文昌魚(yú)前腸內(nèi)胚層的表達(dá)區(qū)域具有較大的陰性范圍,這一陰性區(qū)域與文昌魚(yú)的鰓弓原基相對(duì)應(yīng),說(shuō)明原索動(dòng)物的內(nèi)胚層衍生鰓弓與脊椎動(dòng)物的神經(jīng)脊鰓弓在演化上并不具備器官層次的同源性;文昌魚(yú)Pdx1基因陽(yáng)性的前-中腸消化內(nèi)胚層的表達(dá)狀態(tài)與脊椎動(dòng)物高度同源,對(duì)應(yīng)于盲囊的內(nèi)胚層發(fā)育原基,說(shuō)明文昌魚(yú)盲囊與脊椎動(dòng)物的胰腺具有演化同源關(guān)系;Cdx1基因的表達(dá)狀態(tài)也與脊椎動(dòng)物高度同源,說(shuō)明脊椎動(dòng)物的復(fù)雜腸道系統(tǒng)是從較為簡(jiǎn)單的后腸器官演化而來(lái)的.

核心調(diào)控基因;機(jī)體建構(gòu)模式;內(nèi)胚層;文昌魚(yú)

脊索動(dòng)物門分為頭索動(dòng)物亞門、尾索動(dòng)物亞門和脊椎動(dòng)物亞門等3個(gè)亞門;其中的前兩者合稱為原索類群,被定義為脊索動(dòng)物門的祖先類型[1].原索類群中,文昌魚(yú)為代表性物種,其內(nèi)胚層衍生生理結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單.文昌魚(yú)的前腸內(nèi)胚層主要參與口、鰓和內(nèi)柱(甲狀腺)的發(fā)育形成,中腸內(nèi)胚層主要參與盲囊的發(fā)育形成,后腸內(nèi)胚層主要參與腸道的發(fā)育形成.比較基因組學(xué)研究表明,文昌魚(yú)的基因組極其保守,且5億多年來(lái)形態(tài)變化緩慢,是探索脊椎動(dòng)物機(jī)體建構(gòu)模式演化起源的良好素材[2-3].因此,本文選取白氏文昌魚(yú)為研究對(duì)象,以機(jī)體建構(gòu)模式和演化-發(fā)育生物學(xué)為出發(fā)點(diǎn),通過(guò)研究Sox2,Pdx1和Cdx1三種基因在文昌魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)狀態(tài),探索脊椎動(dòng)物內(nèi)胚層相關(guān)衍生結(jié)構(gòu)的演化起源.

1 試驗(yàn)與方法

1.1 樣本來(lái)源

1.2 基因擴(kuò)增

從文昌魚(yú)胚胎中提取總RNA,應(yīng)用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈c-DNA文庫(kù).以Primer3軟件在線設(shè)計(jì)相關(guān)引物,利用預(yù)混合Taq酶擴(kuò)增基因.

1.3 信息分析

利用Mega6.0軟件,對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行演化系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析,并注釋保守結(jié)構(gòu)域,同時(shí)進(jìn)行種間序列差異分析及T7/Sp6電子定向分析.

1.4 原位雜交

以序列正確的基因?yàn)槟０?合成RNA探針,對(duì)文昌魚(yú)胚胎進(jìn)行整體原位雜交試驗(yàn),具體方法見(jiàn)

城市空間高樓聳立、人口密集，地面綠化受到嚴(yán)峻限制，向建筑的“第五立面”索取綠色，營(yíng)建屋頂花園,是改善生態(tài)和人居環(huán)境的一條嶄新途徑.屋頂面積大約占城市面積的20%～30%，在有限的城市空間中，屋頂綠化是提高城市綠化覆蓋率最有效的方法.屋頂綠化不僅可以增加城市綠量和綠化面積，緩解城市“熱島效應(yīng)”，提升空氣質(zhì)量，而且還可以保護(hù)建筑材料、降低噪音、減少能耗，對(duì)城市生態(tài)環(huán)境的貢獻(xiàn)已被各方認(rèn)可，也必將成為我國(guó)城市綠化的一個(gè)新方向.

文獻(xiàn)[2].

1.5 圖像采集

基于Olympus IX81平臺(tái),利用微分干涉系統(tǒng),采用冷CCD法拍攝試驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1Sox2基因在文昌魚(yú)前腸內(nèi)胚層的表達(dá)狀態(tài)

圖1為文昌魚(yú)Sox2基因的演化同源性分析.結(jié)果顯示,文昌魚(yú)的Sox2基因與脊椎動(dòng)物的Sox2基因在演化上高度同源,其核心結(jié)構(gòu)域高度保守.

圖1 Sox2基因的演化同源性分析

(a) T=12～14 h,早期神經(jīng)胚

(b) T=14 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

(c) T=16 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

(d) 開(kāi)口階段胚胎

圖2為文昌魚(yú)Sox2基因的表達(dá)狀態(tài)圖.由圖可知, 對(duì)生長(zhǎng)期T=12～14 h的早期神經(jīng)胚,Sox2基因主要集中表達(dá)在中-后神經(jīng)管處,參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育形成.T=14 h時(shí),Sox2基因開(kāi)始調(diào)控前腸內(nèi)皮層的發(fā)育.T=16 h時(shí),Sox2基因進(jìn)入發(fā)育調(diào)控最繁忙期,在原有基礎(chǔ)上開(kāi)始調(diào)控中-前腸消化內(nèi)胚層的發(fā)育.當(dāng)文昌魚(yú)胚胎發(fā)育至開(kāi)口階段,Sox2基因在前腸內(nèi)胚層主要集中于調(diào)控口的發(fā)育,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用結(jié)束,對(duì)中-前腸內(nèi)胚層的調(diào)控作用也開(kāi)始減弱.現(xiàn)有研究表明,在脊椎動(dòng)物內(nèi)胚層的發(fā)育過(guò)程中,Sox2基因在前-中腸內(nèi)胚層的表達(dá)具有廣泛的連續(xù)性,從內(nèi)胚層前端一直分布到中-前腸內(nèi)胚層分界線處,與Pdx1基因的表達(dá)范圍緊密銜接[4-5].但Sox2基因在文昌魚(yú)前腸內(nèi)胚層的表達(dá)區(qū)域卻具有較大的陰性區(qū),其對(duì)應(yīng)的是文昌魚(yú)的鰓弓原基. 這表明原索動(dòng)物的內(nèi)胚層衍生鰓弓與脊椎動(dòng)物的神經(jīng)脊鰓弓在演化上并不具備器官層次的同源性,由神經(jīng)脊細(xì)胞主導(dǎo)的外胚層鰓弓的演化出現(xiàn)是脊椎動(dòng)物機(jī)體建構(gòu)模式建立的主要標(biāo)志之一.

2.2 Pdx1基因在文昌魚(yú)前-中腸消化內(nèi)胚層的表達(dá)狀態(tài)

圖3為文昌魚(yú)Pdx1基因的演化同源性分析.結(jié)果顯示,文昌魚(yú)的Pdx1基因與脊椎動(dòng)物的Pdx1基因在演化上高度同源,其核心結(jié)構(gòu)域高度保守.

圖3 Pdx1基因的演化同源性分析

(a) 早期神經(jīng)胚

(b) T=16 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

(c) T=18 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

圖4為Pdx1基因的表達(dá)狀態(tài)圖.由圖可知,早期神經(jīng)胚的Pdx1基因僅集中表達(dá)在第一色素點(diǎn)的原基細(xì)胞群中, 這一現(xiàn)象與Pdx1基因在玻璃海鞘的同時(shí)期表達(dá)狀態(tài)相似[6].當(dāng)?shù)谝簧攸c(diǎn)逐漸發(fā)育形成后,在從T=16 h(生長(zhǎng)期神經(jīng)胚)到開(kāi)口時(shí)期這一廣泛的時(shí)空跨度內(nèi),Pdx1基因集中表達(dá)在前-中腸消化內(nèi)胚層中.類似于Nkx2.5基于與心臟[7-8]、FoxN1基因與胸腺的發(fā)育調(diào)控關(guān)系[9],Pdx1基因是脊椎動(dòng)物胰腺發(fā)育的核心調(diào)控基因.文昌魚(yú)Pdx1基因陽(yáng)性的前-中腸消化內(nèi)胚層對(duì)應(yīng)于盲囊的內(nèi)胚層發(fā)育原基.現(xiàn)有研究已表明,脊椎動(dòng)物肝臟的發(fā)育標(biāo)志基因Hhex僅在文昌魚(yú)的內(nèi)柱(甲狀腺)中表達(dá)[10].因此,文昌魚(yú)的盲囊與脊椎動(dòng)物的胰腺(而非肝臟)同源.脊椎動(dòng)物的胰腺比肝臟演化出現(xiàn)得更早,在脊椎動(dòng)物機(jī)體建構(gòu)模式形成之前,其祖先已擁有了簡(jiǎn)單的胰腺組織;而肝臟與神經(jīng)脊鰓弓類似,其演化出現(xiàn)是脊椎動(dòng)物機(jī)體建構(gòu)模式正式確立的重要標(biāo)志之一.

2.3 Cdx1基因在文昌魚(yú)后腸消化內(nèi)胚層的表達(dá)狀態(tài)

圖5為文昌魚(yú)Cdx1基因的演化同源性分析.結(jié)果顯示,文昌魚(yú)的Cdx1基因與脊椎動(dòng)物的Cdx1基因在演化上高度同源,其核心結(jié)構(gòu)域高度保守.

Cdx1基因的表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)單.圖6(a)顯示,在早期神經(jīng)胚中,Cdx1基因主要集中于神經(jīng)管的尾部表達(dá).由圖6(b)～(d)可知,從T=16 h(生長(zhǎng)期神經(jīng)胚)到開(kāi)口時(shí)期這一廣泛的時(shí)空跨度內(nèi),Cdx1基因始終調(diào)控尾神經(jīng)管和后腸內(nèi)胚層的發(fā)育形成.Cdx1基因在后腸內(nèi)胚層的表達(dá)區(qū)域與Pdx1基因調(diào)控的內(nèi)胚層區(qū)域緊密相連,這2種基因的調(diào)控區(qū)域與脊椎動(dòng)物的消化內(nèi)胚層在演化上高度同源.脊椎動(dòng)物的后腸內(nèi)胚層主要發(fā)育為從小腸到肛門的全部腸道及其附屬結(jié)構(gòu).由此表明,脊椎動(dòng)物的復(fù)雜腸道系統(tǒng)是從簡(jiǎn)單的后腸器官演化而來(lái)的.

圖5 Cdx1基因的演化同源性分析

(a) 早期神經(jīng)胚

(b) T=16 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

(c) T=18 h,生長(zhǎng)期神經(jīng)胚

(d) 開(kāi)口時(shí)期神經(jīng)胚

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)研究Sox2,Pdx1和Cdx1三種基因在文昌魚(yú)內(nèi)胚層的發(fā)育表達(dá)狀態(tài),從演化-發(fā)育生物學(xué)角度闡述了脊椎動(dòng)物內(nèi)胚層衍生器官的演化起源基礎(chǔ).Sox2基因的表達(dá)狀態(tài)顯示，原索動(dòng)物的內(nèi)胚層衍生鰓弓與脊椎動(dòng)物的神經(jīng)脊鰓弓在演化上并不具備器官層次的同源性.Pdx1基因的表達(dá)狀態(tài)顯示，文昌魚(yú)的盲囊與脊椎動(dòng)物的胰腺(而非肝臟)同源.Cdx1基因在原索動(dòng)物內(nèi)胚層發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用顯示，脊椎動(dòng)物的復(fù)雜腸道系統(tǒng)是從簡(jiǎn)單的后腸器官演化而來(lái).

References)

[1]Putnam N H, Butts T, Ferrier D E K, et al. The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype [J].Nature, 2008, 453(7198): 1064-1071.

[2]Holland L Z, Albalat R, Azumi K, et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology [J].GenomeResearch, 2008, 18(7): 1100-1111.

[3]Dehal P, Satou Y, Campbell R K, et al. The draft genome ofCionaintestinalis: insights into chordate and vertebrate origins [J].Science, 2002, 298(5601): 2157-2167.

[4]Grapin-Botton A, Melton D A. Endoderm development: from patterning to organogenesis [J].Trendsingenetics, 2000, 16(3): 124-130.

[5]Zaret K S. Genetic programming of liver and pancreas progenitors: lessons for stem-cell differentiation [J].NatureReviewsGenetics, 2008, 9(5): 329-340.

[6]Corrado M, Aniello F, Fucci L, et al.Ci-IPF1, the pancreatic homeodomain transcription factor, is expressed in neural cells ofCionaintestinalislarva [J].MechanismsofDevelopment, 2001, 102(1/2): 271-274.

[7]Olson E N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart [J].Science, 2006, 313(5795): 1922-1927.

[8]Holland N D, Venkatesh T V, Holland L Z, et al.Amphink2-tin, an amphioxus homeobox gene expressed in myocardial progenitors: insights into evolution of the vertebrate heart [J].DevelopmentalBiology, 2003, 255(1): 128-137.

[9]Bajoghli B, Guo P, Aghaallaei N, et al. A thymus candidate in lampreys [J].Nature, 2011, 470(7332): 90-94.

[10]de Felice M, Di Lauro R. Thyroid development and its disorders: genetics and molecular mechanisms [J].EndocrineReviews, 2004, 25(5): 722-746.

Expression of endodermal kernel regulatory genes during embryonic patterning in amphioxus

He Chunpeng Guan Rui Tian Tian Lu Zuhong

(School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096,China) (Steate Key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210096,China)

The expressions of three kernel vertebrate-endodermal regulatory genes, such asSox2,Pdx1 andCdx1, during amphioxus embryonic patterning are investigated. The results show that compared with vertebrates, the expressing region ofSox2 in amphioxus fore-gut endoderm has a large negative zone which corresponds to the primordium of gill slits, suggesting that the endoderm-derived gill slits in protochordates and the neural-crest-cell-derived pharyngeal gill slits in vertebrates are not evolutionary homologous physiological structures in the organ level. The expressions ofPdx1 in positive fore-mid-gut digestive endoderm of amphioxus, corresponding to the endodermal primordium of diverticulum, are highly homologous with those of the vertebrates, which indicates that the diverticulum in amphioxus is the homologous organ of pancreas. The expressions ofCdx1 of amphioxus are also highly homologous with those of the vertebrates, which reveals that the complicated intestine of the vertebrates is evolved from a simple primitive pioneer.

kernel regulatory gene; body plan; endoderm; amphioxus

2014-11-13. 作者簡(jiǎn)介: 何春鵬(1980—),男,博士生;陸祖宏(聯(lián)系人),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師, zhlu@seu.edu.cn.

何春鵬，管銳,田田，等.文昌魚(yú)內(nèi)胚層發(fā)育相關(guān)核心調(diào)控基因的表達(dá)[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,45(1):41-44.

10.3969/j.issn.1001-0505.2015.01.008

Q951

A

1001-0505(2015)01-0041-04