崔施展，賈東升，謝曉亮，溫春秀，劉靈娣

（河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

多糖具有增強免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生物活性[1]。黃芪是一位傳統(tǒng)中藥食材，被國家衛(wèi)生部收錄為可用于保健食品的藥材，研究表明黃芪多糖的主要生物活性是調(diào)節(jié)機體免疫力，黃芪的其他生物活性在很大程度上都是基于其對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[2]。為攜帶服用方便，常制備成特定的劑型如片劑、顆粒劑、膠囊等，而在制備過程中，輔料的添加會干擾多糖含量的測定。

多糖含量的測定方法主要有苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、DNS法、紅外吸收法、液相色譜法（HPLC）及氣相色譜法（GC）等[3]。最常用于測定多糖含量的方法為比色法，包括苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法是常用的多糖測定方法，簡單可行[4]。由于在酸水解過程中多糖及淀粉、糊精、乳糖等輔料均被水解為單糖，采用比色法測定多糖含量時，輔料干擾多糖的測定。本研究以麥芽糊精為輔料，采用糖化酶水解法，排除輔料在多糖含量測定中的干擾，為其他劑型中多糖含量的測定提供一定的參考。

1 儀器試劑

1.1 儀器

101-1AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；MS105DU型電子天平：METTLER TOLEDO；752PC型紫外光可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；L600型自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；QL-901漩渦混合器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；恒溫水浴鍋：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司。

1.2 試劑

黃芪提取物（自制，總多糖含量40%）；黃芪含片（自制，黃芪提取物50%，麥芽糊精50%）；葡萄糖對照品（批號：HVOD-FZ3K，中國藥品生物制品檢定所，純度≥99%）；糖化酶（批號：20121102，無錫市雪梅酶制劑科技有限公司，10萬U/mL）；麥芽糊精（批號：20130105，西王藥業(yè)有限公司）；乙醇（天津市凱通化學試劑有限公司，分析純）；苯酚（天津市光復精細化工研究所，優(yōu)級純）；濃硫酸（批號：070916，新光化工試劑廠，分析純）；水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖100 mg，加水定容至100 mL，搖勻即得。精密吸取葡萄糖對照品溶液 0.2、0.4、0.6、1.0、1.4 mL，置于 25 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，配成系列對照品溶液。精密吸取各系列對照品溶液2 mL于具塞試管中，以蒸餾水作為空白對照，加入5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，振搖2 min，沸水浴15 min，冷水浴30 min，于490 nm處測吸光度。對葡萄糖濃度（C）與吸光度（A）進行線性回歸，得回歸方程為A=12.59C+0.084，r=0.999，結(jié)果表明，葡萄糖在2.0 μg/mL～14.0 μg/mL線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為97.78%，RSD為2.54%（n=6）。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 黃芪樣品溶液的制備

取干燥黃芪50 g，回流提取兩次，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度為1.08（60℃），即得。

2.2.2 芽糊精樣品溶液的制備

取麥芽糊精10 g加入100 mL容量瓶，定容至100 mL，搖勻即得。

2.3 酶對多糖及糊精的水解

取糊精溶液1mL加入具塞試管中，加糖化酶20mg，調(diào)節(jié)pH到4.5作為試驗組；取濃縮液1 mL加入具塞試管中，加糖化酶20 mg，調(diào)節(jié)pH到4.5作為對照組，58 ℃水浴，分別在 10、20、30、40 min 4 個時間點，取出實驗組和對照組各一支試管測定其吸光度。糖化酶對黃芪多糖及麥芽糊精的水解能力見圖1。

圖1 糖化酶對黃芪多糖及麥芽糊精的水解能力Fig.1 Saccharifying enzyme hydrolysis ability of astragalus polysaccharides and maltodextrin

圖1結(jié)果顯示，試驗組多糖含量隨時間推移逐漸下降，在水浴30 min時達到平衡，對照組含量沒有明顯變化，這說明麥芽糊精被糖化酶逐步水解，而黃芪多糖并未發(fā)生水解。

2.4 酶對麥芽糊精水解條件的優(yōu)化

2.4.1 酶解時間

糖化酶最適pH為4.5～5.5、最適溫度50℃～70℃[5]。設(shè)定酶用量為酶與底物比1∶2（酶過量）、溫度60℃、pH4.5，考察反應(yīng)時間對酶解的影響。取0.1 g/mL麥芽糊精溶液1 mL于具塞試管中，加入糖化酶50 mg，60℃水浴，考察10、20、30、40 min糖化酶對麥芽糊精的水解程度，水浴完成后，加入4 mL無水乙醇沉淀麥芽糊精，5 000 r/min離心10 min，棄上清，加5 mL水復溶沉淀，5 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL定容至100 mL容量瓶，即得樣品液。以蒸餾水作為空白，按照2.1中方法測定麥芽糊精的水解程度。樣品吸光度見表1。

表1 麥芽糊精吸光度Table 1 Maltodextrin absorbance

表1結(jié)果顯示：在酶與底物比為1∶2、溫度為60℃、pH4.5的條件下，麥芽糊精水浴30 min后被充分水解。

酶解時間進一步優(yōu)化：分別選取 26、28、30、32 min進行水解。樣品吸光度見表2。

表2結(jié)果表明在28 min時完全水解，因此將酶解時間設(shè)定為28 min。

表2 麥芽糊精吸光度Table 2 Maltodextrin absorbance

2.4.2 酶解溫度

在酶解時間28 min、pH4.5、酶與底物比1∶2的條件下，考察最適反應(yīng)溫度。分別在50、55、60、65℃的溫度下對麥芽糊精進行水解。樣品吸光度見表3。

表3 麥芽糊精吸光度Table 3 Maltodextrin absorbance

表3結(jié)果顯示，在60℃時麥芽糊精被完全水解。

酶解溫度進一步優(yōu)化：分別選取54、56、58、60℃進行水解。樣品吸光度見表4。

表4 麥芽糊精吸光度Table 4 Maltodextrin absorbance

表4結(jié)果表明在58℃時完全水解，因此將水解溫度設(shè)定為58℃。

2.4.3 酶用量

在酶解時間28 min、溫度58℃、pH4.5的條件下，確定最適酶用量。分別設(shè)定酶與底物比為1∶2、1∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6，考察其對麥芽糊精的水解能力。樣品吸光度見表5。

表5 麥芽糊精吸光度Table 5 Maltodextrin absorbance

表5結(jié)果顯示，當酶與底物比大于1∶5時水解完全，當比例達到1∶6時水解不完全，因此將酶與底物的比例設(shè)定為1∶5。

2.4.4 工藝總結(jié)

酶解時間28 min、溫度58℃、pH4.5、酶與底物比1∶5為麥芽糊精酶解的最佳條件。

2.5 黃芪含片中黃芪多糖的含量測定

測定并對比加入和未加入麥芽糊精的黃芪多糖片中多糖的含量。未加輔料的片劑直接測定，加入麥芽糊精的片劑取粉末，加入糖化酶，按“2.4.4”項下條件反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后按照“2.1”項下方法測定樣品中多糖的含量。所測得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件分析，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05表示組間比較顯差異有統(tǒng)計學意義。試驗結(jié)果見表6。

表6 樣品測定（±s，n=3）Table 6 Sample measurement（±s，n=3）

表6 樣品測定（±s，n=3）Table 6 Sample measurement（±s，n=3）

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有表6可知含麥芽糊精的處方經(jīng)糖化酶水解后測定結(jié)果與對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05），表明可用糖化酶水解麥芽糊精，消除其對多糖測定的干擾。

3 結(jié)論與討論

多糖含量測定的經(jīng)典方法是Dubois等提出的苯酚-硫酸比色法，利用糖類為多羥基醛或多羥基酮在濃硫酸作用下，水解為單糖，單糖在加熱情況下，失去3分子水，生成糠醛衍生物，糠醛衍生物進一步與苯酚生成橙黃色化合物。該有色物質(zhì)在490 nm處有紫外吸收，并在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系[6]。該方法具有操作簡單、快速、重復性好，顯色后穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，但專一性較差，無法區(qū)分多糖種類。

黃芪多糖所含單糖種類主要有L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖，且不同黃芪樣品所含黃芪多糖里含有的單糖種類及含量有較大差別[7-8]。

糖化酶是一種具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端依次水解α-1，4糖苷鍵，切下一個葡萄糖單元，并像β-淀粉酶一樣，使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖[9]。麥芽糊精在加入糖化酶后可以徹底的水解為葡萄糖。

試驗發(fā)現(xiàn)糖化酶不能水解黃芪多糖，可能是黃芪多糖是多種單糖聚合物，各種單糖在某些條件下會以不同的形式縮合，或是黃芪中富含大量的維生素、金屬離子及微量元素與多糖結(jié)合，而掩蓋了多糖本身的非還原性末端，或是黃芪中的糖苷鍵多以β-1，4或β-1，6糖苷鍵居多而造成糖化酶無法水解黃芪多糖。糖化酶無法水解黃芪多糖的具體原因尚不清楚有待進一步研究。

本研究以麥芽糊精為例，為排除中藥片劑中輔料干擾多糖測定提供了較可行的方法，也可作為排除其他輔料干擾的一個參考。

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[2] 姜琛璐,湯承,騫宇,等.黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)作用研究進展[J].食品科學,2013,34(11):327-332

[3] 徐曉飛,陳健.多糖含量測定的研究進展[J].食品科學,2009,30(21):443-448

[4] 夏秀華,王海鷗.銀杏葉多糖兩種測定方法的比較[J].食品研究與開發(fā),2007,28(11)124-127

[5] 郭愛蓮,郭延巍,楊琳.生淀粉糖化酶的菌種篩選及酶學研究[J].食品科學,2001,22(10):45-48

[6] 孫偉偉,曹維強,王靜.DNS法測定玉米秸稈中總糖[J].食品研究與開發(fā),2006,27(6):120-122

[7] 陳艷蕊,毛欣月,金文聞,等.黃芪多糖結(jié)構(gòu)及其單糖組成的氣相色譜-質(zhì)譜研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,23(11):4632-4635

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