逄好勝，張會(huì)慧，李 鑫，丁偉鵬，胡舉偉，林晗婧，敖 紅，孫廣玉

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040)

植被作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要覆蓋部分，在保持水土、涵養(yǎng)土地和生態(tài)系統(tǒng)的固碳等方面具有重要的作用)［1］。大興安嶺是我國(guó)森林最集中也是我國(guó)最大的林區(qū)之一［2］。但是長(zhǎng)期以來(lái)由于人為過(guò)度的采伐和林火等原因?qū)е略摰貐^(qū)出現(xiàn)了森林退化，原生的蒙古櫟(Quercus Mongolica)和興安落葉松(Larix gmelini)混交林等優(yōu)勢(shì)群落逐漸退化，成為了以蒙古櫟林、灌木叢、灌草叢和草地等為優(yōu)勢(shì)的單一群落，使森林資源遭受不同程度的破壞，森林生產(chǎn)力降低，已嚴(yán)重制約該區(qū)森林的生態(tài)功能發(fā)揮［3］，一些山地已成為退化嚴(yán)重的草原化，植被覆蓋度下降，巖石裸露，土壤流失嚴(yán)重，土壤肥力降低，生物多樣性銳減。

森林退化是整個(gè)森林生態(tài)系統(tǒng)的退化，包括植被退化、土壤退化以及鏈接各功能組分能流的衰減。土壤不但是是許多物質(zhì)的儲(chǔ)存庫(kù)，還是是動(dòng)植物分解和循環(huán)的場(chǎng)所［4］，森林土壤是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是林木生存的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。植物對(duì)土壤環(huán)境的重要影響之一是改變土壤微生物群落特征［6］。微生物是土壤中的活力成分，研究表明土壤中微生物量是土壤養(yǎng)分的源或庫(kù)［7］。土壤中物質(zhì)的流動(dòng)和能量的循環(huán)都是在不同種類(lèi)微生物協(xié)同作用下完成的，因此，土壤微生物群落多樣性較土壤微生物量對(duì)反映土壤質(zhì)量的變化更具代表性［8］。通過(guò)Biolog微孔板描述微生物的群落功能特性，能夠簡(jiǎn)單、快速、靈敏地反映微生物群落水平的生理代謝輪廓(CLPP)，該方法可有效地評(píng)估不同生態(tài)環(huán)境所引起的土壤微生物群落變化［9-10］。目前，有關(guān)不同恢復(fù)模式下土壤微生物量和土壤酶活的研究較多［11-12］，但對(duì)不同退化階段土壤微生物功能多樣性的研究還相對(duì)較少。因此，本文以大興安嶺加格達(dá)奇林區(qū)不同退化階段的蒙古櫟林、灌草叢和草地土壤為研究對(duì)象，采用Biolog技術(shù)，研究不同退化階段土壤微生物功能多樣性的差異，旨在為大興安嶺地區(qū)的植被恢復(fù)工作提供理一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2013年7月在位于大興安嶺林區(qū)南緣的加格達(dá)奇林區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)地點(diǎn)位于大興安嶺伊勒呼里山南部東坡(124°01'～124°07'E，50°15'～50°18'N)，地帶性土壤為暗棕壤。該地區(qū)屬于寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候。年平均氣溫為-1.2℃，有效積溫為1 100～2 000℃，無(wú)霜期85～130 d，年均降水量為 494.8 mm［13］。

試驗(yàn)共選取3塊樣地:蒙古櫟林、灌草叢和草地坡地試驗(yàn)樣地。其中，所選取的蒙古櫟林試驗(yàn)樣地存在時(shí)間較長(zhǎng)，原生植被為蒙古櫟和興安落葉松混交林，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的火災(zāi)和人為破壞后形成了以蒙古櫟和白樺等闊葉樹(shù)為主的次生林，優(yōu)勢(shì)樹(shù)種是蒙古櫟，植被覆蓋度大。樹(shù)底下伴生有地榆(Sanguisorba officinalis)、芍藥(Paeonia lactiflora)、唐松草(Thalictrum aquilegifolium)、藜蘆屬(Veratrum Linn..)、單花鳶尾(Iris uniflora)、蒼術(shù)(Atractylodes lancea)、野豌豆(Vicia sepium Linn.)等草本以及一年生的木本植物。灌草叢坡地植物相對(duì)高度較低，約40 cm，除低矮的灌木外，樹(shù)木間生長(zhǎng)著大量的草本植物。主要植被為榆樹(shù)(Ulmus pumila L.)、和胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)等低矮的灌木，樹(shù)木間生長(zhǎng)著大量的草本植物，如苔草(Carex tristachya)、巖敗醬(Patrinia rupestris)、矮蒿(Artemisia lancea Van)、苦參(Sophora flavescens)、狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)、山萵苣(Mulgedium sibiricum)和黃岑(Scutellaria baicalensis)等。草地植物相對(duì)高度最低，主要分布有委陵菜(Potentilla aiscolor Bunge)、野豌豆(Vicia sepium Linn.)、苔草(Carex tristachya)、蚊子草［Filipendula palmata(Pall)Maxim.］、繡線菊(Spiraeasalicifolia L.)、珍珠梅(Sorbaria kirilowii)、地榆(Sanguisorba officinalis)等草本植物，周?chē)樯信d安胡枝子(Lespedeza davurica)、山杏(Prunus armeniaca)等矮小灌木。

1.2 試驗(yàn)土樣的采集

土壤樣品采集于2013年7月22日，選取立地條件基本相似的蒙古櫟林、灌草叢和草地坡地，按五點(diǎn)取樣選取植株，用毛刷輕輕刷下沾附在植物根系上的根際土，剔除石塊和根系殘留后過(guò)2 mm篩，將過(guò)篩的土壤裝入無(wú)菌的封口袋中并用冰盒暫時(shí)存放帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱中保存，用于Biolog-Eco板測(cè)定微生物群落水平的生理活性。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

Classen AT 等［14］采用 Biolog-Eco板測(cè)定土壤微生物群落功能多樣性。具體方法為:首先將土壤樣品在25℃的恒溫箱中活化24 h，然后稱(chēng)取10 g新鮮土樣加入200 mL三角瓶中，再向三角瓶中注入90 mL滅菌的0.85%NaCl溶液，無(wú)菌棉塞塞緊瓶口，放在旋渦振蕩器上震蕩1 min，然后冰水浴1 min，反復(fù)3次，靜置2 min后依次稀釋至10-2和10-3土壤懸浮液。用八孔加樣器向生態(tài)板每孔中加入10-3的土壤懸浮液150 μL，將接種好的微孔板放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)過(guò)程中每隔24 h用酶標(biāo)儀(Sunrise Remote，TECAN)測(cè)定590 nm的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用李鑫等人的方法計(jì)算微生物代謝強(qiáng)度的平均顏色變化率AWCD、物種多樣性指數(shù)(H)、碳源豐富度指數(shù)(S)和均勻度指數(shù)(E)［15］。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和主成分分析(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物利用總碳源的動(dòng)力學(xué)曲線

土壤微生物群落AWCD值隨時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1結(jié)果可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理土壤微生物利用碳源的總量均呈逐漸增加的趨勢(shì)。培養(yǎng)起始的24 h AWCD值較變化較小。培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，AWCD快速增加直至96 h，此時(shí)微生物活性旺盛，碳源開(kāi)始被明顯利用，隨后緩慢增長(zhǎng)，直至趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同退化階段土壤中微生物對(duì)單一碳源利用程度存在明顯差異。其強(qiáng)度大小順序?yàn)?灌草叢土＞蒙古櫟林土＞草地土。各個(gè)階段的AWCD均為灌草叢最高，微生物的代謝活性最強(qiáng);蒙古櫟林土次之;草地土AWCD最小，說(shuō)明其微生物活性最低。從表1可以看出，各退化階段的AWCD在0.29～0.39之間，其中，灌草從和草地土之間的差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)。

圖1 土壤微生物群落AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 AWCD changes with incubation time of different treatments

2.2 土壤微生物對(duì)碳源利用模式的變化

不同退化階段土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析見(jiàn)表1。由表1可以看出，多樣性指數(shù)的變化趨勢(shì)與AWCD相似，灌木叢顯著高于蒙古櫟和草叢土(P＜0.05)，而蒙古櫟和草叢土差異不顯著(P＞0.05)。灌木叢土的碳源豐富度指數(shù)最高，說(shuō)明土壤中可供微生物利用的碳源最多，蒙古櫟層和草地土豐富度指數(shù)較灌草叢明顯降低，但后兩者之間的差異不顯著(P＞0.05);3個(gè)退化階段的均勻度指數(shù)大致相同，差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

表1 不同退化階段土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析Tab.1 Analysis of AWCD for soil microbial communities and diversity indices from different degradation stages

2.3 土壤微生物對(duì)碳源利用模式的變化

不同處理土壤微生物對(duì)6大類(lèi)碳源的利用比率如圖2所示。從圖2可以看出，3個(gè)退化階段土壤微生物對(duì)6大類(lèi)碳源的利用模式大體相同，蒙古櫟土和草地土對(duì)碳源利用程度由大到小排序均為:糖類(lèi)＞氨基酸＞羧酸＞聚合物＞雙親化合物＞氨/胺類(lèi)，灌草層土對(duì)碳源的利用大小順序?yàn)?糖類(lèi)＞氨基酸＞羧酸＞聚合物＞雙親化合物＞氨/胺類(lèi)，3個(gè)階段的碳源除羧酸和聚合物的利用比率發(fā)生明顯變化外，對(duì)其余四大類(lèi)碳源整體的利用趨勢(shì)并沒(méi)有發(fā)生顯著改變。隨著退化程度的進(jìn)一步加劇，土壤微生物對(duì)糖類(lèi)和氨/胺類(lèi)碳源的利用程度越來(lái)越低;對(duì)聚合物類(lèi)碳源的利用，灌草叢土壤微生物能力最低，蒙古櫟層稍高，草層最高;微生物對(duì)羧酸類(lèi)碳源的利用程度大小順序?yàn)楣嗖輩玻久晒艡盗郑静莸?對(duì)雙親化合物和氨基酸兩類(lèi)碳源的利用程度，3種退化階段土壤無(wú)生物無(wú)明顯差異。

圖2 不同處理土壤微生物對(duì)6大類(lèi)碳源的利用比率Fig.2 Utilization rates of 6 types of carbon sources by microbes under different treatments

2.4 土壤微生物對(duì)碳源利用能力多樣性的主成分分析

31種主成分的方差貢獻(xiàn)率如圖3所示。從圖3可以看出，在決定微生物對(duì)碳源利用多樣性的31個(gè)主成分中，前10個(gè)的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到100%。其中，主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率最大，達(dá)到了28.34%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率次之，為20.81%，第3～10主成分的貢獻(xiàn)率相對(duì)較低，為0.11%～12.74%。主成分1和主成分2的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率高達(dá)49.15%，可以解釋變量的大部分信息，是變異的主要來(lái)源。結(jié)果表明:不同退化階段土壤在PC軸上的空間分布差異明顯，其中，灌草叢土分布在第一象限，而草從土和蒙古櫟林土分別位于第二和第四象限，說(shuō)明不同退化階段土壤微生物對(duì)碳源的利用種類(lèi)及程度出現(xiàn)顯著差異。

圖3 31種主成分的方差貢獻(xiàn)率Fig.3 The variance contribution of 31 principal components

圖4 不同處理土壤微生物碳源利用圖譜主成分分析Fig.4 Principal component analysis of carbon sources utilization of soil microbes under different treatments

不同處理土壤微生物碳源利用圖譜主成分分析如圖4所示。從圖4可以看出，PC1軸上，草從土分布在負(fù)軸上，得分在-0.44～-1.40之間，灌草叢土和蒙古櫟林土為正，分別在0.88～1.77和0.49～0.73范圍內(nèi);在PC2軸上，蒙古櫟林土的得分分布在負(fù)軸，范圍是-2.29～-2.86，灌木叢土和草從土集中在正軸，得分分別是2.15～3.31和1.00～2.78。主成分空間分布的不同反映了土壤微生物利用碳源的種類(lèi)和程度存在差異，其中，蒙古櫟層土離散程度最小，灌草叢土和草從土主成分得分的變異程度大，微生物群落功能穩(wěn)定較差。結(jié)合圖5可以說(shuō)明，灌木叢土中可以被微生物利用的碳源種類(lèi)最多，而草從土和蒙古櫟林土中可利用碳源種類(lèi)較少。

圖5 31種碳源的PCA分析Fig.5 Principal component analysis of 31 carbon sourcesH4，G4:氨/胺類(lèi) Amines/amides;A4，B4，C4，D4，E4，F(xiàn)4:氨基酸 Amino acids;F2，A3，B3，C3，D3，E3，F(xiàn)3，G3，H3:羧酸 Carboxylic acids;G2，H2，B1:雙親化合物Miscellaneous;C1，D1，E1，F(xiàn)1:聚合物 Polymers;A2，B2，C2，D2，E2，G1，H1:糖類(lèi)Carbohydrates.

2.5 不同處理土壤微生物碳源利用圖譜主成分分析

31種碳源的主成分荷載因子見(jiàn)表2。由表2可知，第一主成分荷載因子在0.5以上的有15種基質(zhì)，分別為羧酸(5種)、糖類(lèi)(3種)、氨/胺類(lèi)(2種)、氨基酸(2種)、雙親化合物(2種)和聚合物(1種)。其中，γ-羥丁酸的荷載因子大于0.8，說(shuō)明羧酸類(lèi)碳源對(duì)土壤微生物的碳代謝影響最大;第二主成分荷載因子在0.5以上的有11種，說(shuō)明供試土壤微生物群落碳代謝差異主要體現(xiàn)在第一主成分荷載因子高的碳源上，特別是羧酸類(lèi)碳源。

3 討論

AWCD值的變化曲線反映了土壤微生物群落的代謝特征，是反映土壤微生物整體活性的有效指標(biāo)。本研究中，各培養(yǎng)階段AWCD值均表現(xiàn)為:灌木叢土＞蒙古櫟林土＞草地土，說(shuō)明與蒙古櫟林和灌草叢相比，草地土壤微生物群落對(duì)碳源的利用最弱，其微生物群落功能多樣性最低，原因可能是草地群落多樣性較低，根系不發(fā)達(dá)，根系分泌物數(shù)量及種類(lèi)較少，因此可供微生物利用的碳源底物較少。而灌草叢植被凋落枝葉、根系分泌物以及土壤生物代謝物和殘?bào)w分解等豐富了土壤碳源［16］，為土壤微生物提供了充足的代謝底物，從而表現(xiàn)為微生物的代謝活性及群落多樣增加。此外，灌草叢植物種類(lèi)豐富，數(shù)量繁多，植物根系系統(tǒng)較為復(fù)雜，進(jìn)而促進(jìn)了微生物的活動(dòng)［17］。土壤微生物的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、對(duì)碳源利用的豐富度指數(shù)都能表征微生物群落的功能多樣性，可以反映土壤微生物種類(lèi)和功能上的區(qū)別［18］。3種坡地中，灌草叢土壤的碳源豐富度指數(shù)和物種多樣性指數(shù)最高，與其他兩種坡地的差異達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)，說(shuō)明灌草叢土壤中微生物可利用的碳源種類(lèi)最多，微生物的)種類(lèi)和功能多樣性與其他兩種坡地土壤相比較高，原因可能是灌草叢植物種類(lèi)豐富，代謝物種類(lèi)增加，豐富了土壤中可利用碳源的種類(lèi)和數(shù)量，最終引起群落代謝活性的增強(qiáng)。均勻度指數(shù)三者之間沒(méi)有顯著差異，反映了土壤微生物的均勻度不會(huì)隨著退化的加劇發(fā)生明顯的變化。

表2 31種碳源的主成分荷載因子Tab.2 Loading factors of principal component of 31 carbon sources

土壤退化給碳源利用模式帶來(lái)的最大變化發(fā)生在羧酸和聚合物兩大類(lèi)碳源上，說(shuō)明羧酸類(lèi)和聚合物類(lèi)碳源的變化在影響土壤微生物群落功能多樣性方面起著主要的作用。其中，對(duì)聚合物類(lèi)碳源的利用表現(xiàn)為草地最高最高，蒙古櫟土次之，灌草叢最低。而對(duì)羧酸類(lèi)的利用能力為:灌草叢＞蒙古櫟土，草地，二者的趨勢(shì)相反，顯示了以羧酸類(lèi)和聚合物類(lèi)碳源為代謝能源的微生物在灌草叢和草地土壤中數(shù)量差異較大。主成分分析是分析土壤微生物對(duì)碳源利用模式上的差異的重要指標(biāo)［19-21］。主成分荷載因子反映了各個(gè)主成分與土壤碳源利用的相關(guān)程度，結(jié)果顯示:主成分1和主成分2可以解釋變量的大部分信息(累計(jì)方差貢獻(xiàn)率49.15%)，且主成分1起主導(dǎo)作用(方差貢獻(xiàn)率28.34%)，各種碳源與主成分1的相關(guān)系數(shù)中，最大的是羧酸類(lèi)碳源，也就是說(shuō)3個(gè)階段土壤微生物群落碳代謝生理曲線的差異主要是由于微生物對(duì)羧酸類(lèi)碳源利用能力的不同引起的。灌草叢因其復(fù)雜的植被群落結(jié)構(gòu)導(dǎo)致代謝物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在土壤里累積較多，這為土壤中的微生物提供了豐富的可利用碳源，會(huì)使微生物的代謝活動(dòng)加強(qiáng)，釋放出的水分和無(wú)機(jī)物又可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提高地上部分植被的覆蓋度和地下部分植物根系的生長(zhǎng)，如此可形成一個(gè)良性循環(huán)，進(jìn)而達(dá)到涵養(yǎng)土地、保持水土、控制土地荒漠化和水土流失等一系列生態(tài)目的。

綜上所述，大興安嶺林區(qū)的山地草原化引起了土壤微生物群落功能多樣性的下降，表現(xiàn)為碳源底物利用的微生物數(shù)量及活性和微生物對(duì)單一碳源底物的利用能力的降低。但是，灌叢土壤微生物代謝活性較高，對(duì)單一碳源利用能力也強(qiáng)。因此，在大興安嶺加格達(dá)奇土壤退化的林區(qū)，比較有效的恢復(fù)措施是營(yíng)造灌草叢林地。

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