王東麟，吳 龍，林 靜，趙 今

0 引 言

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是一種口腔常見病、多發(fā)病，也被認為是骨疾病的一種，其表現(xiàn)形式為骨質(zhì)疏松。已有多項研究證實骨質(zhì)疏松癥是牙周病的一項危險因素［1－2］。雌激素可調(diào)控骨代謝，具有影響骨生長與變異分化、維持正常的骨轉(zhuǎn)換等多功能作用。雌激素受體(estrogen receptor，ER)是其特異受體，具有組織細胞特異性的ER-α和ER-β 被認為是影響骨量和骨質(zhì)疏松的潛在候選基因［3］。由于地域、環(huán)境、民族等不同，雌激素受體基因多態(tài)性與牙周疾病的發(fā)生和發(fā)展的關系尚未達成一致結(jié)論。有文獻顯示，新疆墨玉地區(qū)牙周病發(fā)病率高達65.2%［4］。本研究旨在了解新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人ERα 與ERβ 基因型的分布情況，探討ER 基因型與成人慢性牙周炎之間相關性，為該地區(qū)維吾爾族成人慢性牙周炎危險性的預測和防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究設計在墨玉地區(qū)采用分層隨機抽樣的方法進行流行病學調(diào)查，并收集口腔樣本。提取該地區(qū)中、重度慢性牙周炎和牙周健康者的全基因組DNA，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法進行基因分型及分析，實驗群體選自前期流行病學調(diào)查采集樣本?？偣布{入199 例個體，實驗分為牙周炎組和對照組，牙周炎組包括97 例中、重度牙周炎患者(男50 例、女47 例)，對照組包括102 例牙周健康者(男48 例、女54 例)。所有研究對象均為維吾爾族，年齡18 ～70歲。中、重度牙周炎的分型標準:附著水平(attachment level，AL)≥3 mm。牙周炎組納入標準包括:口內(nèi)至少有10 顆牙可以進行牙周檢查，其中包括4 顆磨牙(不含第三磨牙);③所有牙周炎組個體均無系統(tǒng)性疾病及已知可影響牙周狀況的疾病。對照組納入標準包括:無系統(tǒng)性疾病，口腔衛(wèi)生情況良好，牙齦無異常，無附著喪失，牙齒無松動，缺失牙不超過3 顆。2 組研究對象均排除懷孕女性并填寫知情同意書。本研究通過本院倫理委員會審查(20140529-01)。

1.2 研究方法 采集每位受試者的口腔頰黏膜拭子標本，無菌棉拭子刮取雙側(cè)頰黏膜脫落細胞，室溫下自然干燥過夜，置于無菌試管中，－20 ℃保存。消毒剪刀將拭子棉絮剝?nèi)≈岭x心管，采用口腔拭子基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生物有限公司)提取DNA，－20℃保存。采用PCR-RFLP 方法檢測受試者ER-α、β 的基因型和等位基因。將PCR 擴增產(chǎn)物進行酶切，凝膠成像儀上確定基因分型。

1.3 PCR 質(zhì)量控制措施 為保證基因分型結(jié)果無偏移，所有標本均在盲法下進行測定。隨機抽取10%樣本在單盲情況下重復測定各位點基因型，以檢驗所測基因型的重復性和可靠性?；蛞镄蛄屑癙CR 反應條件見表1。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)輸入SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包處理。計數(shù)資料采用例數(shù)(百分率)形式表達。牙周炎組和對照組基因型分布和等位基因頻率進行χ2檢驗，單因素Logistic 回歸模型分析ER基因型的危險因素。以P≤0.05 為有統(tǒng)計學意義。

表1 ER 基因引物序列及PCR 反應條件Table 1 ER genomic primer sequences and PCR reaction condition

2 結(jié) 果

2.1 ER-α XbaⅠ和PvuⅡ基因型分布 牙周炎組與對照組在XbaⅠ基因型表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.180 9)，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036 6)。牙周炎組與對照組在Pvu Ⅱ基因型表達上差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021 5)，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014 6)。見圖1、圖2，表2。

圖1 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后電泳圖Figure 1 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme XbaⅠdigestion

圖2 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切后電泳圖Figure 2 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme PvuⅡdigestion

表2 牙周炎組和對照組中的ER 基因型分布［n(%)］Table 2 Distribution of ER genotype in the patients and healthy controls n(%)

2.2 ER-β RsaⅠ和AluⅠ基因型分布 牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.180 9、P=0.094 9)，牙周炎組與對照組在AluⅠ基因型表達上無統(tǒng)計學意義(P=0.059 4)，其等位基因頻率有統(tǒng)計學意義(P=0.048 3)。見圖3、圖4，表2、表3。

2.3 男性研究對象ER-α XbaⅠ與PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ與AluⅠ基因型分布 牙周炎組男性與對照組男性在XbaⅠ基因型表達和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.174 6、P=0.065 5)，在PvuⅡ基因型表達和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.173 4、P=0.208 0)。牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.409 5、P=0.444 3)，在AluⅠ基因型表達和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.112 9、P=0.065 2)。見表4、表5。

圖3 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后電泳圖Figure 3 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme RsaⅠdigestion

圖4 ER 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶切后電泳圖Figure 4 Electrophoresis of ER gene PCR products after restriction enzyme AluⅠdigestion

表3 牙周炎組和對照組的等位基因分布［n(%)］Table 3 Distribution of ER allele in the patients and healthy controls n(%)

2.4 女性研究對象ER-α XbaⅠ與PvuⅡ以及ER-β RsaⅠ與AluⅠ基因型分布 牙周炎組女性與對照組在XbaⅠ基因型表達和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.178 2、P=0.213 5)，在PvuⅡ基因型表達上差異無統(tǒng)計學意義(P=0.074 7)，在其等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.022 9)。2 組女性RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.121 5、P=0.154 4)，在AluⅠ基因型表達和等位基因頻率差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.453 2、P=0.337 8)。見表6、表7。

2.5 ER 基因型的單因素Logistic 分析 單因素Logistic 分析顯示，攜帶Aa 基因型的人群的患病的風險是AA 基因型人群的0.032 倍(95%CI:0.28 ～0.93，P=0.032)，說明Aa 基因型是患牙周炎的保護因素。見表8。

表4 男性研究對象的ER 基因型分布［n(%)］Table 4 Distribution of ER genotype in the male patients and healthy controls n(%)

表5 男性研究對象的等位基因分布［n(%)］Table 5 Distribution of ER allele in the male patients and healthy controls n(%)

表6 女性研究對象的ER 基因分布［n(%)］Table 6 Distribution of ER genotype in the female patients and healthy controls n(%)

表7 女性研究對象的等位基因分布［n(%)］Table 7 Distribution of ER allele in the female patients and healthy controls n(%)

表8 ER 基因型單因素Logistic 分析結(jié)果Table 8 One-way logistic analysis of ER genotype

3 討 論

ER 分為ER-α 和ER-β 2 個亞型。ER-α 主要表達于睪丸、子宮、骨等器官;ER-β 主要表達于前列腺、卵巢、骨等器官。近年來大量的研究證明ER 基因多態(tài)性與骨密度之間存在關聯(lián)，一些研究報道了ER-α 基因多態(tài)性與骨密度之間有一定的聯(lián)系［5－7］。有研究結(jié)果顯示，XX 和PP 基因型對于腰椎骨密度具有保護作用，尤其是對絕經(jīng)前女性及西方女性更為明顯;而對于股骨頸骨密度，XX 基因型具有保護作用，PP 基因型則可能引起負面作用［8］。研究人群之間種族、年齡和環(huán)境的差異或許可以解釋上述研究結(jié)果不一致的現(xiàn)象。但同時也有其他文獻未得出相同結(jié)果［9］。牙槽骨是全身骨骼的一部分，引起全身骨質(zhì)疏松的因素極大可能會引起牙槽骨的骨質(zhì)疏松。Yoshihara 等［1］對日本新瀉地區(qū)70 歲以上居民的研究結(jié)果顯示骨密度與牙周炎存在顯著關聯(lián)。Ozturk 等［2］對土耳其地區(qū)居民研究結(jié)果顯示下頜骨骨密度的參數(shù)和牙周破壞表現(xiàn)為明顯的負相關。

新疆墨玉地區(qū)維吾爾族占人口絕大多數(shù)，人口流動少，具有穩(wěn)定的環(huán)境和其獨特的生活習慣，慢性牙周炎的發(fā)病也有其特點。本研究中發(fā)現(xiàn)在ER-α中，牙周炎組與對照組在XbaⅠ基因型表達差異無統(tǒng)計學意義，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義，說明ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性可能與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族人群牙周易感性無相關關系，而等位基因與人群慢性牙周炎發(fā)病存在相關性;牙周炎組與對照組在PvuⅡ基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義，說明ER-α基因PvuⅡ可能為導致新疆墨玉維吾爾族人群慢性牙周炎的易感因子，其等位基因與慢性牙周病的發(fā)病也存在相關性。這與馬敏等［10］研究結(jié)果相似。經(jīng)過單因素Logistic 分析后發(fā)現(xiàn)，擁有pp 基因型的人群的患牙周炎的風險是擁有PP 基因型的人群的2.25 倍。攜帶Aa 基因型的人群的患牙周炎風險是AA 基因型人群的0.032 倍，說明Aa 基因型是患牙周炎的保護因素。在ER-β 中，牙周炎組與對照組在RsaⅠ基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義;2 組在AluⅠ基因型表達上無統(tǒng)計學意義，其等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義，這提示AluⅠ基因型的分布可能與新疆墨玉維吾爾族慢性牙周炎無相關性，但等位基因可能與新疆墨玉維吾爾族慢性牙周炎易感性相關。女性相比于男性更易出現(xiàn)激素失調(diào)。一些研究表明，ER-α 基因多態(tài)性與性別相關疾病有關，且是流產(chǎn)的危險因素［11－13］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，性別對牙周病的影響中，女性比男性更易發(fā)生［14］。據(jù)推測，ER-α 基因多態(tài)性對牙周炎的影響可能在不同性別間有不同表現(xiàn)，故本研究以性別對分組依據(jù)。值得注意的是女性慢性牙周炎患者和對照組表現(xiàn)出更明顯的統(tǒng)計學差異，然而男性患者和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。這與Zhang等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)ER-α 在女性慢性牙周炎組和對照組中的結(jié)果相似。但經(jīng)過統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，性別并非ER-α 的干擾因素，說明該地區(qū)ER 基因多態(tài)性對牙周炎的影響與性別無關。本實驗對ER-β RsaⅠ多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，199 例受檢者結(jié)果未出現(xiàn)rr 基因型，尚未發(fā)現(xiàn)與此結(jié)果相似的研究，這可能與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族人種有關，故還需擴大樣本量及在新疆不同地區(qū)維吾爾族中進一步研究以證實。

本研究探討了ER 基因與新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人中、重度牙周炎的關系，初步證實新疆墨玉地區(qū)維吾爾族成人中、重度慢性牙周炎易感性與ER-α、ER-β 基因型分布相關。由于本研究中，前期流行病學調(diào)查并未檢查人群的骨質(zhì)疏松指數(shù)，故在今后的研究中需不斷完善，加大樣本量，以進一步證實ER基因多態(tài)性與維吾爾族慢性牙周炎的相關性，以及深入研究雌激素受體基因多態(tài)性與維吾爾族慢性牙周炎的發(fā)病機制。

［1］ 劉 健，翟文靜，吳景景，等.牙齦成纖維細胞-玉米醇溶蛋白-中藥雙黃補復合體對犬牙周組織再生的實驗性研究［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(9):916-920.

［2］ Ozturk Tonguc M，Buyukkaplan US，F(xiàn)entoglu O，et al.Comparison of bone mineral density in the jaws of patients with and without chronic periodontitis［J］.Dentomaxillofacial Radiol，2012，41(6):509-514.

［3］ Bord S，Horner A，Beavan S，et al.Estrogen receptors α and β are differentially expressed in developing human bone［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86(5):2309-2314.

［4］ 桑曉紅，王 順，劉 建，等.新疆墨玉縣維吾爾族成人牙周炎與慢性腎臟病患病率的流行病學研究［J］.中華腎臟病雜志，2010，26(7):510-515.

［5］ 王丹丹，伍西羽，伍賢平，等.女性年齡相關的性激素與骨密度減少率的關系［J］.中華醫(yī)學雜志，2013，93(30):2359-2363.

［6］ Jeedigunta Y，Reddy PR，Kolla VK，et al.Association of estrogen receptor α gene polymorphisms with BMD and their effect on estradiol levels in pre-and postmenopausal women in south Indian population from Andhra Pradesh［J］.Clinica Chimica Acta，2010，411(7-8):597-600.

［7］ Erdogan MO，Yildia H，Artan S，et al.Association of estrogen receptor alpha and collagen type I alpha 1 gene polymorphisms with bone mineral density in postmenopausal women［J］.Osteoporos Int，2011，22(4):1219-1225.

［8］ Wang K，Shi D，Sun L，et al.Association of estrogen receptor alpha gene polymorphisms with bone mineral density:a meta-analysis［J］.Chinese Med J，2012，125(14):2589-2597.

［9］ Yavuz DG，Yoldemir T，Ozaltun K，et al.Estrogen receptor gene polymorphisms in a group of postmenopausal Turkish women:association with bone mineral density［J］.Climacteric，2012，15(4):368-373.

［10］ 馬 敏，楊 程，李曉潔.雌激素受體基因多態(tài)性與寧夏地區(qū)回族和漢族人群慢性牙周炎的關系［J］.口腔醫(yī)學研究，2013，29(7):654-660.

［11］ Mori T，Sawada M，Kuroboshi H，et al.Estrogen-related receptor α expression and function are associated with vascular endothelial growth factor in human cervical cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2011，21(4):609-615.

［12］ Fradet A，Sorel H，Bouazza L，et al.Dual function of ERRα in breast cancer and bone metastasis formation:implication of VEGF and osteoprotegerin［J］.Cancer Res，2011，71(17):5728-5738.

［13］ 張慧明，梁元姣，郝 群，等.雌激素受體相關受體α 與雌激素受體在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達［J］.醫(yī)學研究生學報，2010，23(2):171-174.

［14］ Marques MD，Teixeira-Pinto A，da Costa-Pereira A，et al.Prevalence and determinants of periodontal disease in Portuguese adults:result from a multifactorial approach［J］.Acta Odontol Scand，2000，58(5):201-206.

［15］ Zhang L，Meng H，Zhao H，et al.Estrogen receptor-α gene polymorphisms in patients with periodontitis［J］.J Periodont Res，2004，39(5):362-366.