崔承虎，金世柱，韓明子，李瑞妮，榮為為，孫爆冷

0 引 言

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，任何引起肝損傷的單一或多種因素長(zhǎng)期作用于肝均可引起肝硬化，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。病理組織學(xué)上以肝細(xì)胞大量壞死、結(jié)節(jié)再生、纖維組織增生和假小葉形成為特點(diǎn)［1］。肝硬化動(dòng)物模型是肝硬化實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。CCl4誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型因其操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉、病變典型，目前被廣泛用于肝硬化動(dòng)物模型的建立［2］，但在CCl4模型中有多種因素影響建模效果，如藥物濃度、給藥方式等，而關(guān)于評(píng)價(jià)建模效果的研究尚少。Shen 等［3］皮下注射50%CCl4制造肝硬化模型，Hou 等［4］腹腔注射40%CCl4制造肝硬化模型，Semenov 等［5］則通過灌胃法建立動(dòng)物肝硬化模型。目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)制作肝硬化動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究CCl4不同給藥途徑、濃度、給藥時(shí)間建立肝硬化動(dòng)物模型效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠共90 只，3 周齡，體重80 ～120 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黑)2012003，購(gòu)于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分析純CCl4(西隴化工股份有限公司，批號(hào):140319)，分析純橄欖油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20140422)，無(wú)水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20140612)，日立7020 全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi 公司)。

1.2 建模方法和分組 本實(shí)驗(yàn)有給藥途徑(A)、濃度(B)、給藥時(shí)間(C)3 個(gè)因素，其中A 因素有皮下注射(A1)、腹腔注射(A2)、灌胃(A3)等3 個(gè)水平，B 因素有30% (B1)、50% (B2)2 個(gè)水平，C因素有8 周(C1)、10 周(C2)、12 周(C3)等3 個(gè)水平，共計(jì)18 個(gè)處理組，每組5 只。具體分組方法為A1B1C1:皮下注射+30%CCl4油劑+持續(xù)給藥8周;A1B2C1:皮下注射+50%CCl4油劑+持續(xù)給藥8周;以此類推。每組按各自給藥途徑和濃度給予CCl4-橄欖油溶液，3 天1 次，首次劑量為5 mL/kg，以后為3 mL/kg。每組大鼠以30%乙醇為唯一飲料。

1.3 大鼠模型取材檢測(cè) 各組在規(guī)定時(shí)間采血及處理肝組織。具體方法為腹腔注射水合氯醛予以麻醉，固定后在腹中部做適當(dāng)切口充分暴露腹腔，尋找下腔靜脈用真空采血管采血，待離心后檢測(cè)血清總膽紅素(total bilirubin，TBil)、血清前清蛋白(prealbumin，PA)、血清清蛋白(albumin，Alb)、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(prothrombin time-international normalized ratio，PT-INR)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)等，同時(shí)取肝組織行HE 染色和Masson 三色染色。采用肝硬化疾病評(píng)分模型(scoring model for liver cirrhosis disease，SLCD)和拉埃內(nèi)克纖維化評(píng)分系統(tǒng)(Laennec fibrosis scoring system，LFSS)分別求得血清學(xué)和組織學(xué)上的肝硬化分值R值和L 值。

1.4 評(píng)分系統(tǒng) SLCD 為血清學(xué)評(píng)分系統(tǒng)［6］，選取了年齡、TBil、Alb、PA、PT-INR、SCr 等檢測(cè)指標(biāo)，R值計(jì)算公式如下:

R=0.16×(20-W)/10+0.24×(17.06-T)/16.44+0.2×(A-10.33)/11.95+0.14×(P-2.93)/11.63+0.14×(0.92-I)/0.16+0.12×(32.11-C)/11.61

根據(jù)R 值的大小判斷肝硬化嚴(yán)重程度。R=1表示肝組織正常，0.702≤R ＜1 表示肝炎癥反應(yīng)和局灶性變形，0.542≤R ＜0.702 表示肝出現(xiàn)纖維組織增生現(xiàn)象，0.352≤R ＜0.542 表示假小葉形成為肝硬化期，R ＜0.352 表示肝硬化后期。式中W、T、A、P、I、C 分別代表大鼠年齡、TBil、Alb、PA、PT-INR、SCr 的血清檢測(cè)值。

LFSS 為組織學(xué)上評(píng)估肝纖維化及肝硬化程度的評(píng)分系統(tǒng)［7］，以L 值表示。根據(jù)纖維隔的寬度和數(shù)量以及假小葉的數(shù)量將肝纖維化和肝硬化程度分為0 ～4 期，4 期又分為4A、4B、4C 期，其中0 期為正常肝組織、1 ～3 期為纖維化期、4A ～4C 為肝硬化期，0 ～4C 期分別對(duì)應(yīng)L 值為0 ～6 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，所有定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，統(tǒng)計(jì)方法采用F 檢驗(yàn)，生存時(shí)間曲線分析使用Log-rank檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SLCD 析因分析 腹腔注射組R 值＜皮下注射組和灌胃組，50% CCl4油劑組＜30% CCl4油劑組，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)R 值呈降低趨勢(shì)，析因方差分析結(jié)果顯示3 種因素主效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。析因方差分析表明，給藥方式與給藥時(shí)間及藥物濃度均相關(guān)(P ＜0.05)。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，腹腔注射組R 值降低趨勢(shì)大于皮下注射組和灌胃組。見圖1。

2.2 LFSS 析因分析 各組大鼠肝硬化LFSS 評(píng)分L 值，結(jié)果見表2，可見腹腔注射組L 值＞皮下注射組L 值、灌胃組，50%CCl4油劑組L 值＞30%CCl4油劑組，12 周組＞10 周組＞8 周組。析因方差分析結(jié)果顯示3 種因素主效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，給藥方式與給藥時(shí)間藥物濃度組之間無(wú)相互關(guān)系(P ＞0.05)。

2.3 生存分析 用Kaplan-Meier 法分析A1B1、A1B2、A2B1、A2B2、A3B1、A3B2大鼠的生存率分別為62.22%、52.15%、74.67%、57.03%、61.63%和48.12%，死亡率分別為37.78%、47.85%、25.33%、42.97%、38.37%和51.88%，可見腹腔注射組、皮下注射組、灌胃組的死亡率依次升高，50%CCl4組死亡率＞30%CCl4組;但經(jīng)log-rank 檢驗(yàn)比較各組生存曲線，不同給藥方式組及藥物濃度組之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖2。

表1 各組大鼠SLCD 評(píng)分R 值比較(x±s)Table 1 The R value of different groups of rats based on the Scoring Model for Liver Cirrhosis Disease

表1 各組大鼠SLCD 評(píng)分R 值比較(x±s)Table 1 The R value of different groups of rats based on the Scoring Model for Liver Cirrhosis Disease

時(shí)間30%CCl4油劑皮 下注射50%CCl4油劑30%CCl4油劑腹 腔注射50%CCl4油劑30%CCl4油劑灌胃50%CCl4油劑8 周 0.69±0.04 0.65±0.03 0.60±0.01 0.53±0.03 0.68±0.01 0.63±0.02 10 周 0.62±0.01 0.60±0.01 0.54±0.01 0.52±0.01 0.56±0.03 0.53±0.02 12 周 0.52±0.02 0.49±0.01 0.38±0.03 0.37±0.03 0.51±0.02 0.47±0.03

圖1 SLCD 相互關(guān)系輪廓圖Figure 1 Contour maps for correlation among different groups based on the Scoring Model for Liver Cirrhosis Disease

表2 各組大鼠LFSS 評(píng)分L 值比較Table 2 The L value of different groups of rats based on the Laennec Fibrosis Scoring System

表2 各組大鼠LFSS 評(píng)分L 值比較Table 2 The L value of different groups of rats based on the Laennec Fibrosis Scoring System

時(shí)間30%CCl4油劑皮 下注射50%CCl4油劑30%CCl4油劑腹 腔注射50%CCl4油劑30%CCl4油劑灌胃50%CCl4油劑8 周 1.33±0.44 1.50±0.50 2.75±0.37 3.00±1.00 2.00±0.50 2.67±0.44 10 周 3.33±0.44 3.67±0.89 3.50±0.50 4.67±0.44 3.67±0.44 4.00±0.67 12 周 3.50±0.50 5.25±0.37 4.00±0.50 5.50±0.50 3.75±0.37 5.33±0.44

圖2 大鼠生存曲線比較Figure 2 Survival curves of different groups of rats

3 討 論

目前主要肝硬化模型包括酒精性、化學(xué)性損傷、膽管結(jié)扎性、血吸蟲性、免疫性損傷［21］、肝炎性肝硬化模型［22］。其中肝炎性肝硬化模型最常用的方法有肝炎病毒轉(zhuǎn)基因模型和人類肝嵌合模型，但均因小鼠的免疫機(jī)制對(duì)病毒抗原耐受，無(wú)法觀察到宿主的免疫應(yīng)答過程，肝炎性肝硬化模型常用來(lái)評(píng)估抗病毒藥物的藥效。

最常用的化學(xué)性損傷肝硬化模型應(yīng)用的藥物有CCl4，其為無(wú)色透明的具有強(qiáng)烈肝毒性的揮發(fā)性液體，肝是CCl4主要的代謝場(chǎng)所?，F(xiàn)普遍認(rèn)為CCl4經(jīng)肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝生成高活性三氯甲基自由基(-CCL3)，后者啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化作用破壞肝細(xì)胞膜，引起肝細(xì)胞損傷，最終形成肝硬化［2，8］。CCl4誘導(dǎo)肝硬化動(dòng)物模型由于其操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉、病變典型，目前廣泛被用于肝硬化動(dòng)物模型的建立，但成模率低、死亡率高是其缺點(diǎn)。

我們的結(jié)果顯示不同給藥方式與動(dòng)物模型肝硬化嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，即腹腔注射組肝硬化程度重于灌胃組和皮下注射組。腹腔注射是將藥物打入腸道漿膜層外，藥物被腹膜吸收后經(jīng)門靜脈直接進(jìn)入肝，有操作簡(jiǎn)單、吸收快、肝藥物濃度高等優(yōu)點(diǎn)［9］。因此，腹腔注射法能夠縮短造模時(shí)間，提高生存率。皮下注射CCl4由于其經(jīng)吸收后進(jìn)入全身循環(huán)，不但增加了腦、腎等毒性，還減少了肝藥物濃度，延長(zhǎng)造模時(shí)間，并且易引起注射部位的壞死和膿腫，降低造模效率［10-11］。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果還顯示隨著藥物濃度的增加和給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，肝硬化程度越明顯。這與肝硬化發(fā)生和發(fā)展的病理過程一致。隨著CCl4濃度的升高，產(chǎn)生更多的自由基從而發(fā)揮更大的毒性作用。但是藥物濃度的提高縮短造模時(shí)間的同時(shí)增加了死亡率。本實(shí)驗(yàn)中50%CCl4濃度組死亡率高于30%組，但經(jīng)log-rank 檢驗(yàn)比較兩組生存率差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與B 因素選取水平數(shù)少有關(guān)。

乙醇作為肝硬化重要致病因素，與CCl4聯(lián)合應(yīng)用能夠提高造模效率。長(zhǎng)期過度飲酒可導(dǎo)致人類肝硬化的發(fā)生和發(fā)展。乙醇在肝經(jīng)代謝產(chǎn)生乙醛，后者能與蛋白質(zhì)結(jié)合干擾正常的代謝從而產(chǎn)生直接細(xì)胞毒性作用。同時(shí)乙醇能誘導(dǎo)P450活性，加速CCl4向-CCL3轉(zhuǎn)化，從而增加CCl4的肝毒性［12］。因此，聯(lián)合應(yīng)用乙醇不僅能減少CCl4濃度，而且還能夠縮短造模時(shí)間，提高造模率［13-15］。

目前臨床常用的肝硬化評(píng)分有CTP 分級(jí)和終末期肝病模型［23］，但有諸多缺點(diǎn)［16-17］。CTP 分級(jí)將肝硬化分為A、B、C 3 個(gè)等級(jí)，缺乏連續(xù)性，并且腹水和肝性腦病的分級(jí)受主觀因素的影響，難以客觀正確的分級(jí)。MELD 能夠準(zhǔn)確評(píng)估晚期肝硬化，但對(duì)早期肝炎癥、壞死、纖維化等病變無(wú)法做出判斷，并且因公式中缺乏門脈高壓及并發(fā)癥的相關(guān)指標(biāo)，無(wú)法判斷門脈高壓及并發(fā)癥的預(yù)后。SLCD 相比CTP 分級(jí)和MELD 有以下優(yōu)勢(shì):①所用到的6 項(xiàng)指標(biāo)能客觀的反映肝功能儲(chǔ)備［18-19］，使評(píng)分依據(jù)更加客觀;②不僅能對(duì)終末期肝硬化進(jìn)行評(píng)估，還能對(duì)早期肝臟炎癥和纖維化階段進(jìn)行評(píng)估;③通過以數(shù)值的形式表達(dá)，使評(píng)分更具有準(zhǔn)確性和連續(xù)性。病理學(xué)檢查是診斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)肝纖維化評(píng)分系統(tǒng)［7，20，24］，比如Metavir 評(píng)分單純把肝硬化階段分成一個(gè)類別，并沒對(duì)肝硬化亞型分類，顯著降低了評(píng)估細(xì)致性。而LFSS 評(píng)分不僅簡(jiǎn)單易懂，并且通過對(duì)肝硬化亞型分類，顯著提高了評(píng)估的連續(xù)性，增加了肝硬化實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性和可行性［7］。

本實(shí)驗(yàn)尚有諸多局限性。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)考慮到因素?cái)?shù)與水平數(shù)不宜過多，在藥物濃度因素上只選取了2 個(gè)水平，這只能代表2 個(gè)水平組生存曲線之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不能代表其他藥物濃度(如空白對(duì)照組)的情況。在操作過程中有些不可避免因素可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比如操作時(shí)引起的組織損傷(灌胃時(shí)對(duì)食管和胃的損傷，皮下注射、腹腔注射時(shí)引起的局部出血或壞死等)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本LFSS 評(píng)分系統(tǒng)雖然對(duì)肝硬化亞型分類，但評(píng)分為整數(shù)，仍缺乏連續(xù)性，影響了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

總之，不同給藥方式及藥物濃度誘導(dǎo)動(dòng)物肝硬化模型有顯著影響，腹腔注射法不僅操作簡(jiǎn)單，而且能夠縮短造模時(shí)間，減少動(dòng)物死亡率，最終提高造模效率，值得在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛推廣。

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