吳 仲，張 勛，孔祥佳，徐 偉，洪振豐

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

復(fù)方熊膽茵陳顆粒微生物限度檢查及控制菌檢查方法驗(yàn)證*

吳 仲，張 勛，孔祥佳，徐 偉，洪振豐△

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

目的 建立復(fù)方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。方法 按中國(guó)藥典方法進(jìn)行菌回收率試驗(yàn)及控制菌檢查方法驗(yàn)證。結(jié)果 5種試驗(yàn)回收率試驗(yàn)均為70%以上，其中細(xì)菌以培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行檢查，酵母菌、霉菌以常規(guī)法即可。控制菌檢查中，大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌3者試驗(yàn)組均可檢出試驗(yàn)菌，陰性組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陰性菌對(duì)照組亦無(wú)菌生長(zhǎng)。結(jié)論 本試驗(yàn)建立的方法可作為復(fù)方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證的依據(jù)。

復(fù)方熊膽茵陳顆粒；微生物限度；控制菌檢查

復(fù)方熊膽茵陳顆粒是本校阮時(shí)寶教授的驗(yàn)方，由熊膽粉、茵陳、山楂等 7 味中藥組成，具有清肝利濕、化痰祛瘀的功效，用于肝膽濕熱、痰濁血瘀型脂肪肝，目前已開發(fā)為院內(nèi)制劑[1]。為控制復(fù)方熊膽茵陳顆粒的質(zhì)量，我們對(duì)本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定[2]，為有效反映本品的污染情況，建立復(fù)方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立適合該制劑的微生物限度檢查方法，為制劑進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH-B11-500型、30-35℃)、生化培養(yǎng)箱(SPX-150型25-28℃)、勻漿器(300-8000r/min)、電熱恒溫水浴鍋(HH-8型)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS型)、電子天平(SE602F型)。

1.2 試液

1.2.1 稀釋劑與培養(yǎng)基 pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，均由中檢所提供。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、4—甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。上述培養(yǎng)基配方與中國(guó)藥典2010版配方均相同。

1.2.2 供試藥 復(fù)方熊膽茵陳顆粒(由福建中醫(yī)藥大學(xué)生產(chǎn)，批號(hào)20120901、20121012、20121203)。

1.2.3 試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50 094]等均由福建省藥品檢驗(yàn)所提供。

2 方法

2.1 菌液的制備

2.1.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用菌液的制備 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml至9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，梯度稀釋，使之含菌數(shù)約為50～100 cfu/mL的菌懸液，作為試驗(yàn)菌計(jì)數(shù)備用。

經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁培養(yǎng)物1 mL至9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，梯度稀釋至使之含菌數(shù)約為50～100 cfu/mL的菌懸液，作為試驗(yàn)菌計(jì)數(shù)備用。

經(jīng)23～28℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入3～5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80)洗脫孢子，并將孢子懸液吸出轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管內(nèi)[3]，以0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液梯度稀釋至使之含孢子數(shù)約為50～100 cfu/mL的孢子懸液，作為試驗(yàn)菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 控制菌檢查方法驗(yàn)證用菌液的制備 接種新鮮培養(yǎng)的大腸埃希菌至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于30～35℃培養(yǎng)18～24 h。取上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物梯度稀釋，制成每1 mL含菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液，備用。

接種乙型副傷寒沙門菌至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18～24 h。取上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物梯度稀釋，制成每1 mL含菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備 取供試品10 g，流加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分搖勻，作為1∶10供試液備用。

3 回收率的測(cè)定

3.1 常規(guī)法測(cè)定

3.1.1 試驗(yàn)組 取供試液、試驗(yàn)菌液1ml分別注入平皿內(nèi)，并傾入15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，平行重復(fù)2次，按平皿法計(jì)數(shù)。

3.1.2 菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，取試驗(yàn)菌注入平皿內(nèi)，并傾入15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，平行重復(fù)2次，按平皿法計(jì)數(shù)。

3.1.3 供試品對(duì)照組 取供試液1 mL注入平皿內(nèi)，分別傾入15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，平行重復(fù)2次，按菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

3.1.4 陰性對(duì)照組 取試驗(yàn)用的稀釋液(pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)1 mL，注入平皿內(nèi)，并傾入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各平行制備2個(gè)平皿。

3.2 培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定(金黃色葡萄球菌)

3.2.1 試驗(yàn)組 取供試液1 mL等量分注5個(gè)平皿內(nèi)，試驗(yàn)菌加1 mL，傾注15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法計(jì)數(shù)。

3.2.2 菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，取試驗(yàn)菌注入平皿內(nèi)，并傾注15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法計(jì)數(shù)。

3.2.3 供試品對(duì)照組 取供試液1 mL等量分注5個(gè)平皿內(nèi)，并傾注15～20 mL瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，平行制備2個(gè)平皿，按菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

3.2.4 陰性對(duì)照組 取試驗(yàn)用的稀釋液0.2 mL，注入無(wú)菌平皿內(nèi)，傾入培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)。

3.3 分別統(tǒng)計(jì)上述各組菌落數(shù)，分別計(jì)算每株試驗(yàn)菌的回收率，結(jié)果見表1。

表1 3批熊膽茵陳顆粒的菌種回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 控制菌的測(cè)定

4.1 大腸埃希菌的檢查

4.1.1 膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌 試驗(yàn)組：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL，加入供試液10 mL及大腸埃希菌菌懸液1 mL。供試品對(duì)照組：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL，加入供試液10 mL。陰性對(duì)照組：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 mL，加入稀釋液10 mL。上述各組于30～35℃培養(yǎng)18～24 h，必要時(shí)則延長(zhǎng)至48 h。

4.1.2 大腸埃希菌檢查 按《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定的“微生物限度檢查法”，將上述3組培養(yǎng)、觀察，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：按照常規(guī)法，3批樣品大腸埃希菌試驗(yàn)組均可檢出試驗(yàn)菌，陰性組及陰性菌對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。

表2 大腸埃希菌檢查結(jié)果

4.2 大腸菌群的檢查

4.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)組：取3批供試液各1 mL和大腸桿菌試驗(yàn)菌液，于10 mL膽鹽乳糖(BL)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。陰性菌對(duì)照組：取三批供試液各1 mL和金黃色葡萄糖球菌試驗(yàn)菌液，置10 mL膽鹽乳糖(BL)發(fā)酵培養(yǎng)內(nèi)。陰性對(duì)照組：取三批供試液各1 mL和pH7.0蛋白胨-氯化鈉緩沖液1 mL置10 mL膽鹽乳糖(BL)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。

4.2.2 大腸菌群檢查 按《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定的“微生物限度檢查法”將上述3組分別進(jìn)行培養(yǎng)、觀察，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：按照常規(guī)法，3批大腸菌群試驗(yàn)組均可檢出試驗(yàn)菌，陰性組及陰性對(duì)照菌均無(wú)菌生長(zhǎng)。

表3 大腸菌群檢查結(jié)果

4.3 沙門菌的檢查 分別取本品10 g 加入3瓶200 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，1瓶加入1 mL沙門菌菌液作為試驗(yàn)組，1瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液作為陰性菌對(duì)照組，另取1瓶加入1 mL沙門菌菌液作為沙門菌陽(yáng)性對(duì)照組，按沙門菌檢查法檢查。

表4 沙門菌檢查結(jié)果

由表可知，陰性對(duì)照組未檢出沙門菌，試驗(yàn)組可檢出沙門

菌?？刹捎贸Ｒ?guī)法進(jìn)行本品的沙門菌檢查。

5 討論

根據(jù)《藥典》規(guī)定，微生物限度檢查回收率試驗(yàn)中，若試驗(yàn)組的菌回收率不低于70%，則照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)；若低于70%，可能存在抑菌現(xiàn)象，可嘗試培養(yǎng)基稀釋法。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)及本試驗(yàn)結(jié)果，本品細(xì)菌用培養(yǎng)基稀釋法檢查，霉菌、酵母菌用常規(guī)法測(cè)定即可[4-6]。

控制菌檢查驗(yàn)證時(shí)，陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌；若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。由試驗(yàn)結(jié)果可知，可用常規(guī)方法進(jìn)行控制菌的檢查。

[1]李煌，徐偉，鄭海音，等.復(fù)方熊膽茵陳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2013，20(9)：52-54.

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Microbial Limit Test and Control Bacteria Method Validation ofCompoundBearBileandCapillaryHerbGranule

WU Zhong1, ZHANG Xun1, KONG Xiang-jia1, XU Wei1, HONG Zhen-feng2

(1.SchoolofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,Fujian;2.SchoolofChinese-WesternMedicineIntegration,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,Fujian)

Objective: To establish a microbial limit test method forCompoundBearBileandCapillaryHerbGranuleto ensure accurate and reliable test results. Methods: Bacteria recovery rate tests and control bacteria method validation were conducted according to Chinese Pharmacopoeia. Results: The rate of five recovery tests was more than 70%, wherein the bacteria were checked by culture medium dilution method. Yeasts and molds could go in the conventional method. In the control bacteria check, test organisms could be detected from Escherichia coli, coliform bacteria and Salmonella groups and no bacteria growth was in Gram-negative group. There was also no bacteria growth in the negative control. Conclusion: The method established in the test may provide a basis for microbial limit test and control bacteria method validation ofCompoundBearBileandCapillaryHerbGranule.

CompoundBearBileandCapillaryHerbGranule, microbial limit, control bacteria check

福建省科技重大專項(xiàng)(NO：2010YZ0001-1)

R285.5

A

1007-2349(2015)07-0066-03

2015-03-16)

△通信作者：洪振豐，E-mail：wzrenwz@sohu.com。