李秀紅,林國華,鄒卓成

(1.廣州市越秀區(qū)第二人民醫(yī)院,廣州 510180;2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣州 510405)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病(DM)常見的一種慢性并發(fā)癥,主要的常見癥狀包括早飽、惡心、腹脹、嘔吐、打嗝、食欲不振、體重減輕等。目前,國內外現代醫(yī)學對DGP的病因及發(fā)展機理尚未完全闡明,治療上也無重大突破,而中醫(yī)藥在DGP治療上逐漸顯示其優(yōu)勢。本研究將對糖尿病胃輕癱的胃腸激素的作用機理進行動物實驗的研究,在中醫(yī)學辨證論治理論指導下,結合現代醫(yī)學對 DGP的發(fā)病機制和辨證分型的認識,探討有效的針灸療法的作用機理,明確電針療法對DGP的療效,以期更廣泛地應用于臨床,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級健康 SD雄性大鼠 100只,體重為180～220 g,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)及實驗均在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心 SPF級實驗室進行。

1.2 DM模型制作[1]及分組

將100只SD大鼠先穩(wěn)定飼養(yǎng)3 d,均經尿糖試紙檢測為尿糖陰性,剔除陽性動物。隨機分為對照組 30只和造模組70只。造模組給予禁食12 h后稱重,按大鼠總重量比稱取 STZ,放置在干燥滅菌瓶內,外用錫紙包好,將檸檬酸緩沖液及裝有未溶解的 STZ的瓶子置冰浴(2～8℃),干燥避光保存。再將STZ用0.1 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.5)配制成濃度為1%的溶液,按 55 mg/kg的劑量經腹腔一次性注射,確保 STZ在溶解后30 min內注射完畢。注射后1、3、7 d分別測定大鼠非空腹尾靜脈血糖值,選用血糖濃度持續(xù)＞16.65 mmol/L。尿糖在3+～4+且能維持1星期以上者確定為DM模型建立。DM大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10星期,所有大鼠均自由進食。造模組使用STZ注射造成大鼠一部分胰島B細胞功能的破壞,外周組織對胰島素不敏感,同時喂以高脂(高糖)飼料,兩者結合便可誘導出病理、生理均接近人類2型DM的動物模型。在造模成功的大鼠中分別隨機選取30只作為模型組和治療組。

1.3 治療方法

1.3.1 治療組

取足三里、中脘、胃俞穴,左右兩側輪換取穴,取穴方法參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》。將大鼠放入自制的大鼠固定器中,75%乙醇常規(guī)消毒后,采用0.25～0.40 mm×13 mm毫針進行針刺,針刺深度為0.3～0.4寸,針刺后接上海泰成科技發(fā)展有限公司生產的LH202H型韓氏穴位神經刺激儀,刺激波形選用15 Hz等幅波,強度以穴位皮膚輕微抖動為度,留針15 min。治療后正常進食。每日1次,5次為1個療程,療程間休息2 d,共治療3個療程。

1.3.2 模型組

在治療組接受治療時,模型組大鼠也放入固定器中固定相同的時間。

1.3.3 對照組

不作任何處理。

1.4 觀察指標及檢測

1.4.1 一般狀況

每日觀察動物的飲食情況、大小便、活動狀況、皮毛光澤度及死亡情況,每星期測體重1次。

1.4.2 血糖檢測

所有大鼠實驗結束前1 d尾靜脈取血測非空腹血糖。

1.4.3 胃腸推進率

末次電針后,各組大鼠禁食24 h,再經口給予10%炭粉混懸液(其中活性炭和阿拉伯膠各占10%)按1 mL/100 g體重用量灌胃,30 min后用乙醚進行麻醉,麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死,打開腹腔用鑷子輕輕提取上端至幽門、下端至回盲部的腸管,并置于托盤上,再將小腸拉成直線,用直尺測量胃腸推進指標,胃腸推進指標通過以下公式計算得出,胃腸推進率=(炭粉前端至幽門擴約肌距離/幽門括約肌至小腸末端距離)×100%。

1.4.4 血清胃動素(MOT)、生長抑素(SS)的測定

各組大鼠麻醉后從眼睛取血 4 mL,置于無抗凝離心管(測血清MOT和 SS),全血標本置于 4℃過夜后于1000×g離心20 min,取上清置于-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。并送本校核醫(yī)學室用 ELISA法測定,所有標本均在同一批中完成測定。試劑在使用前平衡至室溫。

1.4.5 胃竇組織MOT、SS的測定

剖腹取胃竇部新鮮組織各 1塊,置于﹣20℃冰箱保存?zhèn)溆脛驖{。將制備好的 10%勻漿用離心機3000 r/min左右離心10～15 min,取上清液置于-20℃或-80℃保存?zhèn)溆盟蜋z。

1.5 統計學方法

所有數據均以均數±標準差表示,應用 SPSS13.0統計軟件進行處理,多組資料間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗期間,對照組大鼠表現為機警、活潑、反應快、毛發(fā)光滑、皮毛致密、有光澤,生長、進食及二便均正常,實驗期間無死亡。造模組大鼠造模后第3天開始出現進食飲水量增加,尿量增多,隨后出現持續(xù)性多飲、多食(進食飲水量為對照組的2～3倍),尿量增多,體重減輕;至第4星期時部分大鼠出現食量減少,大便性狀改變,稀便與干結便均可見到;第6星期時絕大部分大鼠除仍有多飲、多尿外,還可見到食量明顯減少、消瘦、精神倦怠、反應遲鈍、皮毛疏松無光澤、腹部膨隆、大便干稀不等。造模組實驗期間大鼠未治療前死亡9只(12.9%),具體死亡原因不明,估計跟最初造模成功后,血糖升高過快出現高血糖有關;或飲水量不足,因為饑渴相互間互相廝殺等。治療期間未見死亡及丟失情況。

治療組治療1個療程(5 d)后,大部分大鼠癥狀逐步好轉,開始出現食量增加,大便性狀得到不同程度的改善,皮毛逐漸恢復光澤,體重增加。

2.2 各組大鼠治療后一般情況比較

由表 1可見,治療組和模型組大鼠體重及胃腸推進率與對照組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01),提示DGP模型誘導成功。治療組治療后體重及胃腸推進率與模型組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01),提示治療組能明顯改善DGP大鼠體重及胃腸推進率。

表1 各組大鼠治療后一般情況比較 (±s)

表1 各組大鼠治療后一般情況比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 體重(g) 胃腸推進率(%)治療組 30 361.07±31.401)2) 58.50±4.331)2)模型組 30 282.77±33.561) 45.43±6.111)對照組 30 518.67±38.97 69.60±3.73

2.3 各組大鼠血糖值變化比較

由表2可見,治療組和模型組大鼠造模后、治療10星期后及治療后血糖值與對照組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。治療組治療后血糖值與模型組比較,差異統計學無意義(P＞0.05)。治療組治療后血糖值與同組治療10星期后比較,差異具有統計學意義(P＜0.01)。

表2 各組大鼠血糖變化比較 (±s,mmol/L)

表2 各組大鼠血糖變化比較 (±s,mmol/L)

注:與對照組比較1)P＜0.01;與同組治療10星期后比較2)P＜0.01

組別 n 造模后 治療10星期后 治療后治療組 30 28.17±1.161) 26.21±0.991) 22.56±1.041)2)模型組 30 28.21±0.961) 26.24±0.941) 26.17±1.101)對照組 30 5.74±0.63 5.52±0.62 5.65±0.57

2.4 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較

由表 3可見,治療組和模型組血清及胃竇組織中MOT和SS含量與對照組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。治療組治療后血清及胃竇組織中 MOT和SS含量與模型組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較(±s,pg/mg)

表3 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較(±s,pg/mg)

注:與對照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 部位 MOT SS治療組 30 血清 164.86±20.711)2) 107.59±8.271)2)胃竇組織 122.67±7.181)2) 58.90±11.491)2)模型組 30 血清 256.68±21.451) 73.59±6.481)胃竇組織 46.70±6.771) 66.99±10.291)對照組 30 血清 51.59±13.55 57.13±6.55胃竇組織 22.18±6.30 29.36±8.23

3 討論

3.1 關于STZ制作糖尿病大鼠模型的研制

大鼠腹腔內或尾靜脈注射STZ導致糖尿病是通過STZ選擇性作用于大鼠胰腺,造成大鼠胰島B細胞不可逆損傷而不能產生胰島素,從而使血糖升高,是一種胰島素依賴型DM動物模型[2]。本研究中,我們給造模組大鼠按55 mg/kg的劑量一次性腹腔注射配制好的STZ液。造模24 h后血糖≥16.65 mol/L,穩(wěn)定5 d即作為造模成功。結果顯示造模成功的大鼠實驗期間血糖持續(xù)≥16.65 mol/L,尿糖陽性(++～++++),并伴有典型的“三多一少”、體重增長較慢,而對照組大鼠無“三多一少”表現,體重上升較快。以上研究表明,本實驗所復制的DM模型是成功的,STZ法可以通避選擇性破壞胰島細胞成功造成DM模型。胃腸功能障礙是DM常見并發(fā)癥。

3.2 本研究中DGP大鼠模型的確立

從實驗過程中觀察發(fā)現,在動物模型的喂養(yǎng)過程中大約從DM形成的4星期左右開始,部分DM大鼠的進食量開始下降,大便量與大便性狀出現異常,6星期后絕大部分DM大鼠除有多飲、多尿外,還可見到食量明顯減少、消瘦、精神倦怠、反應遲鈍、皮毛疏松無光澤、腹部膨隆,大便干稀不等,并隨時間的延長由輕到重,其異常逐漸顯著。本實驗在DM模型建立約10星期后,采用炭粉推進率反映大鼠胃腸運動功能的指標,結果表明模型組的胃腸排空指數較低,與對照組相比較有顯著性差異(P＜0.01)。說明DM確實存在胃腸運動功能減弱現象,提示DM大鼠胃排空延遲,存在糖尿病性胃輕癱。本實驗所建立的大鼠DGP模型是成功的。

3.3 電針治療選穴原則

本實驗根據俞募合配穴法選用后三里、中脘、胃俞三個穴位進行電針治療。《難經本義》:“陰陽經絡,氣相交貫,臟腑腹背,氣相通應?！闭f明臟腑之氣與俞募穴是相互貫通的?！端貑枴り庩枒蟠笳摗?“故善用針者,從陰引陽,從陽引陰;陽病治陰,陰病治陽?！边x用胃的俞募穴胃俞及中脘相配,一陽一陰,使陽氣上升、濁陰下降,從而恢復中焦的升降功能。中脘、胃俞分別位于上腹部和背部,雖分別屬于任脈和膀胱經,但二穴分別是胃之募穴和背俞穴,是本腑之氣輸注或匯聚之處,故也可治療胃腑病。足三里為胃之下合穴,《靈樞·邪氣藏府病形》:“合治內腑?！薄端貑枴た日摗?“治府者治其合?！毕潞涎ㄊ侵委熈“Y的主要穴位,而本病病位主要在胃,胃屬腑,取足三里有和胃通腑、降濁止嘔之功;《四總穴歌》:“肚腹三里留。”取足三里以降氣除脹之功,與中脘和胃俞相配。故諸穴合用具有健脾和胃、健運中州、通腑降濁的功效,能調節(jié)腸胃運動,明顯減輕DGP各癥狀。吳湘等[3]發(fā)現針刺足三里后,糖尿病胃輕癱患者胃收縮頻率、胃竇收縮幅度及胃排空率明顯增加。同時,胃腸的運動是由電生理控制的[4],電針也在一定程度上影響著其電生理活動。

3.4 各指標檢測結果的討論

本實驗采用炭粉推進率反映大鼠胃腸運動功能的指標,為目前常用反映胃腸運動功能的檢測指標[5],主要用于了解固體食物排空情況。本研究中結果顯示,模型組胃腸推進率與對照組比較,差異具有統計學意義(P＜0.01),說明用STZ造模的DM大鼠確實存在胃腸運動功能減弱現象,提示本實驗DGP模型誘導成功。治療組胃腸推進率較對照組顯著降低(P＜0.01),較模型組顯著增加(P＜0.01),提示電針有較強的促胃腸運動作用。

治療組治療后血糖值與模型組比較,差異無統計學意義(P＞0.05),但與同組治療10星期后比較,差異具有統計學意義(P＜0.01),提示電針不僅有較強的促胃腸動力作用,還可能通過加速胃排空而調節(jié)DGP大鼠的血糖。其機理可能是電針促使胃腸蠕動加快,食物均勻地排入小腸,餐后對營養(yǎng)物質吸收較模型組及電針治療前提前。研究表明穴位刺激能在一定程度上降低糖尿病者血糖水平,而加速胃腸排空也能在一定程度上改善血糖水平。因此,尚不能確定本研究治療組治療后血糖濃度值較造模組及同組治療前實驗觀察低是由穴位刺激直接降糖引起還是由加速胃排空引起的,或是兩者同時起作用的結果。

MOT屬于興奮胃腸運動的腦腸肽,是啟動消化間期胃腸移行性復合運動的重要激素[6],靜脈注射MOT對正常人消化期的胃腸運動無明顯影響,但卻能明顯加速DGP患者餐后胃對液體和固體食物的排空。有研究[7-11]報道,SS可以抑制生長激素、甲狀腺刺激激素、胰島素、胰高血糖素的分泌,可抑制胃蛋白酶、胃泌素的釋放,并且減少胰腺的內外分泌以及胃小腸和膽囊的分泌,降低酶活性,對胰腺細胞有保護作用,可影響胃腸道吸收和營養(yǎng)功能?？梢娤嚓P的文獻報道[12]。本實驗觀察糖尿病大鼠血清MOT和SS的含量,研究結果顯示模型組大鼠血中MOT水平顯著升高,與對照組有顯著性差異,模型組血清SS升高不明顯,而電針能明顯降低DM大鼠血中胃動素水平以及提高SS水平。Kawagishi T等[13]發(fā)現伴神經病變的DGP患者體內MOT水平較對照組高,正常對照組胃排空同血漿MOT水平呈正相關,即MOT水平高,胃排空也較快,但DGP患者卻成負相關,即MOT水平比正常人高,而胃排空反而比正常人慢。另外,李麗霞等[14]在觀察電針對DGP大鼠MTL及胃泌素的影響時發(fā)現DGP大鼠血漿中MOT顯著升高,電針治療后血漿MOT水平下降,說明電針能改善DGP大鼠血中高MOT狀態(tài),這與本研究結果相一致。DM患者血中胃動素水平增高可能與其作用效能下降有關,是一種代償性表現。SS可以抑制胃腸激素的分泌,電針降低糖尿病血中MOT可能與SS水平提高及加速胃排空功能有關。本實驗中模型組血清及胃竇組織中SS均較對照組顯著升高,這與其他文獻研究[15]一致。在胃竇組織中,模型組MOT水平升高不明顯而SS升高,原因可能是當DM大鼠血中MOT升高時,外周組織的MOT水平則相對降低,并且可能與胃竇分泌的SS相對增高有關。而治療組中胃竇組織MOT水平升高及SS水平下降,這一結果與林國華等[16]的研究一致,說明電針能顯著改善這一狀況,胃竇組織MOT升高,胃排空則加強,故實驗研究提示,電針可改善DGP大鼠的胃腸動力障礙。此外,本實驗結果顯示電針能夠升高DM大鼠血清SS水平和降低胃竇組織中的SS水平,但二者之間的相互變化關系尚不明確,亦未見相關的文獻報道,故有待進一步的研究。

[1]曾新生,姚微微,丁芝祥,等.腹腔注射鏈脲佐菌素構建糖尿病大鼠模型[J].華夏醫(yī)學,2013,26(5):895-897.

[2]孫子林,葛祖愷.糖尿病動物模型及其進展[J].中國糖尿病雜志,1999,7(4):227-229.

[3]吳湘,劉磊,郝悅,等.針刺“足三里”對糖尿病胃輕癱患者胃動力學的影響[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報,2008,14(8):100-103

[4]王玲,周呂.胃動素和胃泌素引起大鼠胃竇平滑肌細胞收縮的信號轉導通路[J].生理學報,2000,52(4):272-276.

[5]路長林,王成林,何成,等.神經肽基礎與臨床[M].上海:第二軍醫(yī)大學出版社,2000:163-169.

[6]周呂,柯美云,李在琉,等.胃腸動力學:基礎與臨床[M].北京:科學出版社,1994:665-669.

[7]吳慧萍,陸紅.糖尿病胃輕癱患者血清生長抑素改變及意義[J].實驗診斷與治療雜志,2006,20(5)330-332.

[8]鄒鋼,邵豪,陸澤元,等.糖尿病患者血糖與胃泌素、胃動素、生長抑素相互關系的初步探討[J].海南醫(yī)學,2005,16(10):1-2.

[9]戎士玲,李佃貴,陳麗革,等.糖尿病大鼠血漿和胃腸組織胃動素、膽囊收縮素和生長抑素含量的變化[J].胃腸病學,2006,11(8):503-504.

[10]孫大勇,趙亞剛,周梅花,等.穴位電針對犬血漿降鈣素基因相關肽和生長抑素含量的影響[J].廣州醫(yī)學院學報,2007,35(3):17-19.

[11]盧岱靜.針藥并用對反流性食管炎患者胃泌素、胃動素的影響[J].上海針灸雜志,2010,29(4):218-220.

[12]錢秋海,王志程,魏建萍.糖胃安對四氧嘧啶糖尿病胃輕癱模型大鼠胃動素、胰高血糖素及生長抑素的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(5):34-35.

[13]Kawagishi T, Nishizawa Y, Okuno Y, et a1. Effect of cisapride on gastric emptying of indigestible solids and plasma motilin concentration in diabetic autonomic neuropathy[J]. Am J Gastroenterol, 1993,88(6):933-938.

[14]李麗霞,林國華.電針對糖尿病胃輕癱大鼠MTL、GAS的影響[J].河南中醫(yī)學院學報,2006,21(3):25-27.

[15]吳慧萍,陸紅.糖尿病胃輕癱患者血清生長抑素改變及意義[J].實驗診斷與治療雜志,2006,20(5):330-332.

[16]林國華,聶斌,陳楚云.電針對糖尿病大鼠胃竇組織 MTL、GAS調控作用研究[J].安徽中醫(yī)學院報,2005,24(4):29-30.