蘭州大學第二醫(yī)院風濕免疫科 (蘭州 730030)

王曉元 沈海麗▲

艾拉莫德對類風濕關節(jié)炎滑膜細胞體外干預實驗研究*

蘭州大學第二醫(yī)院風濕免疫科 (蘭州 730030)

王曉元 沈海麗▲

目的：觀察艾拉莫德(T-614)對類風濕關節(jié)炎(RA)滑膜細胞(FLS)體外培養(yǎng)時，增殖生長能力的影響，探討艾拉莫德的對RA的治療機制。方法：采用噻唑藍(MTT)法和流式細胞儀觀察抗風濕藥物艾拉莫德T-614對RA-FLS增殖變化，T-614分為高劑量組(1000μg/ml)、中劑量組(250μg/ml)和低劑量組(5μg/ml)，干預期間通過TNF-α(10ng/ml)刺激FLS并共孵育48h，并收上清液檢測IL-8水平表達。結果：高濃度組T-614較低濃度組及正常對照組對RA的FLS體外增殖具有明顯的抑制作用，檢測上清IL-8明顯減低。結論：T-614對TNF-α刺激下的RA-FLS有抑制增殖的作用，且趨化因子IL-8分泌水平減低，提示T-614對RA滑膜炎具有的免疫抑制調控作用。

類風濕性關節(jié)炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一種以滑膜炎為病理基礎的慢性多關節(jié)炎性的自身免疫疾病，患者關節(jié)滑膜炎嚴重程度與RA病情活動和預后密切相關，滑膜炎的病理表現為：血管翳生成、炎性因子分泌及骨和軟骨的破壞。艾拉莫德(Iguratimod)是一具有新的抗炎和免疫調節(jié)性質的小分子，成分為兩酰胺基、甲?；图谆交前饭倌軋F的對氧奈酮衍生物[1]。本項研究觀察T-614對活動期RA患者的滑膜細胞體外培養(yǎng)的干預，探討T-614抑制滑膜細胞，調控細胞因子等作用，了解T-614對RA治療的免疫學基礎，為RA患者臨床用藥，得到及時、準確治療，改善預后提供依據。

對象與方法

1 研究對象 選取2013年10月至2014年2月在蘭州大學第二醫(yī)院就診RA患者，行關節(jié)鏡滑膜清理術5例，男性1例，女性4例，年齡42～68歲，平均年齡55.9歲，均符合1987年美國風濕病協(xié)會(ACR)修訂的診斷分類標準。

2 方 法

2.1 滑膜組織的分離培養(yǎng)方法： 無菌條件下，將滑膜組織剪碎至1mm3小塊，通過加入膠原酶(Sigma公司)37°C消化1h，離心棄去上清，再使用胰蛋白酶消化30min，過200目細胞濾網,沖洗離心棄上清。用10%FBS-DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2中培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，棄去未粘附細胞，繼續(xù)培養(yǎng)瓶貼壁傳代細胞，每3～5d換液，用0.25%胰蛋白酶EDTA消化并傳代，臺盼蘭染色檢測細胞活動大于90%以上。

2.2 RA的FLS觀察：4～6代滑膜細胞與不同劑量的T-614共撫育48h，進行的蘇木素-伊紅染色(HE)染色，觀察滑膜細胞形態(tài)。

2.3 艾拉莫德(T-614)(先聲藥業(yè)公司惠贈)每片25mg，粉碎后震蕩20min后，溶解在2ml的DMSO中，過40μm篩網，配置成10mg/ml，分裝EP管中，細胞培養(yǎng)適應DMEM液稀釋10倍使用微孔過濾器過濾分裝使用。

2.4 噻唑藍(MMT)法細胞增殖檢測：培養(yǎng)4-6代的RA滑膜細胞計數后，加入96孔板培養(yǎng)撫育24h，加入T-614濃度為：1000、250、5μg/ml，同時，加入刺激物TNF-α每孔10ng/ml(TNF-α購自Sigma分裝)，設立空白和對照采用5%DMSO，共同孵育48h，MTT法測定各孔OD值，每組8個副孔，計算細胞的存活分數(Survival fraction，SF)。

2.5 細胞因子檢測: 收集相應處理的滑膜細胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測細胞培養(yǎng)上清中的IL-8含量，具體操作按相應的試劑盒說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，兩樣本數據之間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 RA滑膜細胞染色觀察：采用第4～6代滑膜細胞，具有生長突，呈梭型或者多形性，可見分裂相，核仁明顯。T-614干預后滑膜成纖維細胞增殖速度明顯減慢，細胞碎片和細胞核固縮，大小不等(附圖)。

A:空白組滑膜細胞呈多形性，細胞核邊界、核仁清楚，突觸較長，生長旺盛；B：250 μg/mlT-614共培養(yǎng)48h后，滑膜細胞整體數量減少，少見滑膜細胞破損，細胞核明顯縮小，邊界不清楚，破損表現，核仁不清楚

附圖 FLS的蘇木素-伊紅染色(×200倍)

2 T-614對RA滑膜細胞增殖的影響:T-614不同給藥組濃度加入RA滑膜細胞培養(yǎng)后，入各組SF值下降，不同給藥濃度組間比較有統(tǒng)計學差異。對照組與加T-614藥物組均值比較有統(tǒng)計學差異，見表1。

表1 T-614對TNF-α誘導的RA滑膜細胞 SF的檢測

與對照組比較，*P<0.05

3 上清IL-8水平：RA滑膜細胞加入T-614，不同給藥組濃度，不同給藥濃度比RA滑膜細胞培養(yǎng)48h上清，檢測IL-8水平結果，對照組與加T-614藥物組均值比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2。

表2 T-614對TNF-α誘導的RA滑膜細胞培養(yǎng)上清液IL-8的檢測

與對照比較，*P<0.05

討 論

類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種以滑膜炎為病理基礎的自身免疫性疾病，發(fā)病2年即可出現不可逆的關節(jié)骨質破壞。關節(jié)滑膜的過度增殖是RA關節(jié)炎，RA病理表現為滑膜組織充血，細胞異常增生，形成滑膜絨毛，最終形成血管翳，侵入骨和軟骨下的骨質，是造成骨質破壞的主要原因，通過探討藥物的免疫調控作用，觀察抑制滑膜增殖是基礎研究的重點，也是臨床用藥治療的基礎。T-614是一種小分子免疫制劑，在臨床實驗中，對減輕疾病活動，改善病情獲得了很好的治療作用。

本研究觀察RA滑膜細胞的體外培養(yǎng)，應用T-614藥物干預實驗，使用滑膜細胞的炎癥刺激因子TNF-α的作用下，觀察其增殖特點，同時檢測細胞因子IL-8分泌表達水平。之前文獻報道提示，在無介質激活時，骨關節(jié)炎的成纖維滑膜細胞在體外出現增殖潛能，高劑量艾拉莫德對骨關節(jié)炎成纖維細胞分化及表達有直接抑制作用。并有報道在體外實驗中，使用T-614干預滑膜成纖維細胞，發(fā)現T-614通過抑制RA-FLS的c-fos mRNA表達，具有降低FLS增殖能力作用[2，3]。本文得到結果與文獻報道一致，但本實驗通過TNF-α炎癥刺激因子干預滑膜細胞，TNF-α是RA關節(jié)炎中最重要的致病因子，不僅具有刺激滑膜細胞增生，啟動MAPKs3個亞家族成員活化，導致細胞因子網絡失調，還可誘導T細胞分化，造成Th1/Th2失衡，最終關節(jié)炎癥加重，與RA發(fā)表及病程密切相關[4]。通過TNF-α刺激干預培養(yǎng)RA成纖維滑膜細胞后，我們觀察到T-614對FLS具有更為明確的抑制增殖作用，并隨劑量增加而抑制作用增強。故應用T-614具有明顯抑制滑膜增殖的作用，提示在臨床應用中，T-614具有改善關節(jié)炎癥、緩解病情的作用。

趨化性細胞因子(Chemokines ,CK)是一組由細胞核炎性細胞產生的具有多種生物學效益功能的小分子生物活性家族，白細胞介素-8(IL-8)基因于1988年克隆，IL-8是與炎癥極為密切的細胞因子，中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和內皮細胞等，在外源性或內源性因子：如脂多糖，TNF-α等誘導下可生產大量IL-8以及多種免疫炎癥因子，如NO、PGE-2、IL-1、IL-6等，進一步介導炎癥反應，激活粒細胞發(fā)生變形、游走、趨化和聚集，在炎癥部位產生侵潤作用[5]。文獻提示使用不同濃度IL-8作用常規(guī)培養(yǎng)條件下的RA成纖維滑膜細胞時，發(fā)現有直接促進其增殖作用，并與濃度呈劑量依賴性。本研究得出，隨著T-614劑量增加，滑膜細胞上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614治療滑膜炎的新靶點，為抑制滑膜細胞生產IL-8，從而減少了關節(jié)炎癥的致病因素，同時減少滑膜細胞的增殖，在急性關節(jié)炎治療中T-614具有積極治療作用。

上述研究顯示，RA滑膜細胞在T-614干預條件下，關節(jié)滑膜細胞的增殖水平減低， IL-8檢測水平下降。提示T-614治療RA的靶點作用可能抑制滑膜細胞增殖，同時減少IL-8關節(jié)炎致炎病因的免疫機制。

[1] 劉 丹,陳 妤,丁漢飛，等. 艾拉莫德(T-614)在類風濕關節(jié)炎基礎實驗與臨床療效的研究進展[J]. 中國新藥雜志,2013,22(9):1052-1055.

[2] 舒 強,李興福,侯懷水，等. 艾拉莫德對骨關節(jié)炎滑膜成纖維樣細胞特性的影響[J]. 中華風濕病學雜志,2006,10(7):389-392，449.

[3] 舒 強,李興福,劉花香，等. 類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維樣細胞增殖特性的體外研究[J]. 山東大學學報(醫(yī)學版),2006,11:1095-1099.

[4] 劉青松，蔣 紅，唐 中.丹參對類風濕關節(jié)炎患者滑膜細胞腫瘤壞死因子α表達的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2009，8(3):74-76.

[5] Juarranz M, Mihara M. The roles of interleukin-6 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatol(Oxford),2004,43(4):416-422.

(收稿：2014-09-09)

*甘肅省科技廳基金項目(144FKCA060)

蘭州市科學技術局基金項目(2013-3-26)

@艾拉莫德 關節(jié)炎，類風濕/免疫學 滑膜 細胞增殖 白細胞介素-8/分析 體外發(fā)生

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.011

▲通訊作者