西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(西安 710003)

王麗萍 劉曉霞 武金娥▲ 周 鑫▲ 劉 萍Δ

不同濃度葡萄糖對(duì)脂肪細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響*

西安市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(西安 710003)

王麗萍 劉曉霞 武金娥▲周 鑫▲劉 萍Δ

目的：研究不同濃度葡萄糖對(duì)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：對(duì)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)小鼠3T3-L1細(xì)胞，分別給予25mmol/L、40mmol/L及70mmol/L濃度的葡萄糖作用24h，提取細(xì)胞RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，檢測(cè)脂肪細(xì)胞因子Vaspin、IL-6及脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：隨葡萄糖濃度的增高，Vaspin、IL-6 mRNA的表達(dá)增高，APNmRNA的表達(dá)減低。結(jié)論：培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的變化是影響脂肪細(xì)胞Vaspin、IL-6及APNmRNA表達(dá)的因素。

多種脂肪因子在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中所起的作用越來(lái)越受到關(guān)注。本研究通過(guò)對(duì)3T3-L1細(xì)胞予以不同濃度葡萄糖培養(yǎng)，了解葡萄糖對(duì)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

材料和方法

1 材 料

1.1 細(xì)胞株：3T3-L1脂肪前體細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO公司)，胎牛血清(購(gòu)自杭州四季青生物制品公司)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutal-1-methylxan-thine，購(gòu)自Sigma公司)，胰島素(Insulin，購(gòu)自Sigma公司)，Trizol(購(gòu)自Gibco BRL公司)，Prime Script RT reagent Kit(大連寶生物工程)，SYBR?Premix Ex TaqTMII(大連寶生物工程)。

1.3 儀器：CO2細(xì)胞孵育箱(購(gòu)自Thermo Scientific)，倒置顯微鏡XD-202(購(gòu)自江南光學(xué)儀器廠)，CFX96熒光定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Biorad公司)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： 用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度孵箱中孵育。待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)按一定密度接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞融合2d后，再給予0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1mg/L胰島素、0.25μmol/L地塞米松及DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)48h，繼而換用含1mg/L Insulin的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48h，隨后再用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2d換1次。誘導(dǎo)分化8～10d，當(dāng)3T3-L1細(xì)胞90%以上呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞表型時(shí)，給予不同濃度葡萄糖作用24h，Trizol法提取RNA。

2.2 細(xì)胞鑒定： 誘導(dǎo)前后使用油紅O染色鑒定，證明是成熟脂肪細(xì)胞(油紅O是一種可以特異地和細(xì)胞內(nèi)三酰甘油結(jié)合的紅色染料，與未分化細(xì)胞和細(xì)胞外脂質(zhì)不結(jié)合)。吸棄培養(yǎng)板里的分化培養(yǎng)基；1×PBS沖洗細(xì)胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸鹽緩沖液4 ml/孔，室溫固定1 h；吸棄固定液；加入油紅O溶液，室溫染色3 h；吸棄染色劑；無(wú)菌三蒸水沖洗2次，洗去未著色染料；顯微鏡下觀察，照相。

2.3 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)液中 SYBR Green I 的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。SYBR?Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，所以可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的SYBRTMGreen I熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。Vaspin上游引物序列：5'-CTT CCT ATC CCC ACT GAG-3' ，下游引物序列：5'-CTT TGT GTC CTC CGT CTC-3' ；APN上游引物序列：5'-GCA GAG ATG GCA CTC CTG GA -3' ，下游引物序列：5'-CAG GGA AGC CTC TTT CTC CT-3' ；IL-6上游引物序列：5'-AGC CAG AGTCCT TCA GAG -3'，下游引物序列5'-GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3'; 內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh )上游序列5'-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T -3' ，下游引物序列 5'-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C -3' 。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS l6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以Mean±sd表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功誘導(dǎo)分化成熟脂肪細(xì)胞(圖1)。

圖1 誘導(dǎo)分化3T3-L1細(xì)胞

2 各組脂肪因子表達(dá)情況： 25mmol/L、40mmol/L、及70mmol/L葡萄糖作用3T3-L1細(xì)胞24h，Vaspin/gapdh比值分別為1.27±0.26、2.29±0.16及3.00±0.52，IL-6/gapdh比值分別為1.07±0.06、1.58±0.11及2.27±0.11，APN/gapdh比值分別為1.17±0.16、0.61±0.04及0.42±0.04。隨著培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度的增加，脂肪細(xì)胞Vaspin及IL-6 mRNA的表達(dá)升高，APN mRNA的表達(dá)減低，除Vaspin/gapdh比值在40mmol/L及70mmol/L組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖2)。

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)脂肪細(xì)胞因子Vaspin、IL-6及APN mRNA表達(dá)的影響(**P<0.01) 討 論

目前認(rèn)為，脂肪組織除了是脂肪存儲(chǔ)和代謝的場(chǎng)所外，還是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。脂肪組織能釋放多種細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的糖代謝、脂代謝及能量代謝起著重要的調(diào)控作用。這些脂肪細(xì)胞因子通過(guò)多種途徑影響胰島素的生物學(xué)效應(yīng),參與胰島素抵抗(IR)。因此，在2型糖尿病、代謝綜合征(MS)及肥胖的發(fā)生、發(fā)展及發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

脂聯(lián)素(Adiponectin ，APN)是脂肪組織特異性分泌的脂肪細(xì)胞因子。研究顯示，血漿APN濃度與高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗呈負(fù)性相關(guān)。多元線性回歸模型研究結(jié)果顯示，與APN相關(guān)的眾多因素中，腰臀比(WHR)、M-rate(胰島素刺激葡萄糖攝取率)和空腹胰島素水平是血漿APN的獨(dú)立影響因素[1]。因此可以看出，與血糖、體脂含量比較，胰島素的敏感性及空腹胰島素濃度與血漿APN的關(guān)系則更為密切。俞利紅[2]研究顯示葡萄糖濃度變化不是影響3T3-L1細(xì)胞APN mRNA表達(dá)的主要因素。本研究顯示隨著不同濃度葡萄糖作用3T3-L1細(xì)胞24h，APN mRNA的表達(dá)呈遞減，且各濃度間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，血糖是否直接影響APN仍有待進(jìn)一步研究。

IL-6是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，它是由人IL-6基因所編碼的一種生物活性的糖蛋白。IL-6主要是由單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成，脂肪和肌肉組織能產(chǎn)生少量IL-6。IL-6與內(nèi)分泌激素、神經(jīng)遞質(zhì)及某些效應(yīng)物質(zhì)等組成重要的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，參與機(jī)體的各種病理生理過(guò)程，尤其廣泛而精細(xì)地調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和分泌功能[3]。高血糖促進(jìn)IL-6的生成，且IL-6的濃度與血糖濃度呈正相關(guān)?？寡趸瘎┕入赘孰淖柚垢哐钦T發(fā)的血漿細(xì)胞因子的升高，說(shuō)明炎性因子的釋放可能與高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。

Vaspin是一種脂肪細(xì)胞因子，由Hida等利用差異篩選基因方法，在腹型肥胖2型糖尿病動(dòng)物模型OLETF大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中分離到一種新基因OL-64[5]，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，具有胰島素增敏作用。研究發(fā)現(xiàn)Vaspin表達(dá)受多種因素的影響，如性別、年齡、飲食、運(yùn)動(dòng)，藥物及激素等。并與肥胖、2型糖尿病、多囊卵巢綜合征、心血管疾病和非酒精性脂肪肝等疾病有密切的關(guān)系。Tan等[6]研究發(fā)現(xiàn),人體網(wǎng)膜脂肪組織Vaspin mRNA 表達(dá)和血清Vaspin水平均與血糖水平呈顯著正相關(guān)。Gulcelik NE等[7]發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者中，血清Vaspin水平與HbA1c正相關(guān)，與胰島素水平負(fù)相關(guān)。本研究顯示Vaspin的表達(dá)隨葡萄糖濃度的升高而升高，但更高濃度的葡萄糖70mmol/L與40mmol/L間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在一定范圍內(nèi)，血糖的升高可以促進(jìn)Vaspin表達(dá)。

[1] Mathias F,Johannes K，Susanne N，etal．Adiponectin gene expresion is inhibited by B-adrenergic stimulation via protein Kinase A in 3T3-L1 adipocyte[J]．FEBS Letters，2001，507：142．

[2] 俞利紅，谷 衛(wèi). 不同葡萄糖濃度對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué)，2005,27(12)：901-903.

[3] Miesinger M Y,Serge H,Stefan W,etal. Development of an IL-6 inhibitor based on the functional analysis of murine IL-6 Ra[J].Chem and Biol,2009,16(7):783-794.

[4] Goyal R,Singhai M,Faizy A F. Glutathione peroxidase activity in obese and nonobese diabetic patients and role of hyperglycemia in oxidative stress[J]. Midlife Health,2011,2(2):72-76.

[5] Hida K, Wada J , Zhang H ,etal. Identification of genes specifically expressed in the accumulated visceral adipose tissue of OLETF rats[J]. J Lipid Res , 2000 , 41 : 1615-1622.

[6] Tan BK, Heutling D, Chen J,etal. Metformin decreases the adipokine vaspin in overweight women with polycystic ovary syndrome concomitant with improvement in insulin sensitivity and a decrease in insulin resistance[J]. Diabetes,2008,57: 1501-1507.

[7] Gulcelik NE, Karakaya J, Gedik A,etal. Serum vaspin levels in type 2 diabetic women in relation to microvascular complications[J].Eur J Endocrinol,2009,160:65-70.

(收稿：2014-12-02)

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013JM4048)

葡萄糖濃度 3T3-L1細(xì)胞 Vaspin IL-1 脂聯(lián)素

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.006

▲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

△通訊作者