李 想，時(shí) 湛，馬瑞寧，孫曉青

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

·基礎(chǔ)研究·

siRNA靶向沉默鞘氨醇激酶 -1對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

李 想1，時(shí) 湛1，馬瑞寧1，孫曉青2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院，2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221000)

目的 探討siRNA靶向沉默SPHK1基因?qū)η傲邢侔㏄C-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染人前列腺細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞，通過RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)特異性siRNA對(duì)SPHK1基因在mRNA和蛋白水平上的沉默效果，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長曲線并觀察細(xì)胞增殖被抑制情況，Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞在侵襲力方面的變化。結(jié)果 經(jīng)SPHK1 siRNA轉(zhuǎn)染后，PC-3細(xì)胞中SPHK1的表達(dá)均低于陰性對(duì)照組(NC)和空白組(P<0.05)；并且SPHK1 siRNA抑制細(xì)胞的增殖能力，使其凋亡率增加，侵襲力降低。結(jié)論 通過抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞SPHK1基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并降低侵襲力，使其凋亡增加，顯示出在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中SPHK1基因發(fā)揮著重要的作用。

RNA干擾；前列腺癌；鞘氨醇激酶-1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

許多西方國家中，前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，占男性癌癥死因第二位。隨著近年來我國人群生活水平的改善和人口老齡化，我國前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，成為影響我國居民健康的主要惡性腫瘤之一[1]。同時(shí)，我國前列腺癌與西方前列腺癌發(fā)生有所不同。喪失了手術(shù)良機(jī)，預(yù)后較差，生存期也較短，目前尚無滿意的治療方法和技術(shù)。RNAi(RNA interference,RNAi)是在mRNA水平上高度特異的基因沉默技術(shù)，其介導(dǎo)識(shí)別并切割同源性mRNA分子，從而致使該基因不被表達(dá)[2]。鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPHK)是維持細(xì)胞內(nèi)鞘脂平衡的重要限速酶，目前已知在哺乳動(dòng)物中存在兩種SPHK異構(gòu)酶—SPHK1(主要存在于細(xì)胞質(zhì))和SPHK2(主要存在于細(xì)胞核)[3]。其主要是通過增加細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)并降低神經(jīng)酰胺和鞘氨醇，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖。其中S1P是一個(gè)重要的存活因子，能直接對(duì)抗神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘氨醇(Sp)，從而能阻止細(xì)胞內(nèi)Cer和Sp水平的過度升高，三者之間的動(dòng)態(tài)平衡決定著細(xì)胞的生死與存亡[4]，同時(shí)多種腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)SPHK1其本身的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯升高，并且腫瘤惡性程度以及預(yù)后等臨床病理特征與表達(dá)水平相關(guān)，因此被普遍認(rèn)為是癌基因[5]。近來研究表明，SPHKl的活性增強(qiáng)在多種腫瘤中起到抵抗放、化療的作用，其中也包括前列腺腺癌[6]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察特異性小干擾RNA靶向沉默SPHK1基因?qū)θ饲傲邢侔㏄C-3細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響，希望為未來治療前列腺癌提供一種新的方法和視角。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺PC-3細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。3條SPHK1 siRNA及陰性對(duì)照組siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成。RPMI 1640培養(yǎng)基購于Thermo科技公司。無支原體胎牛血清購于杭州四季青公司。Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司。TRNzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購于天根生化科技公司。SPHK1和內(nèi)參照GAPDH的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。兔抗人SPHK1多康隆抗體采購自美國Cell Signaling Technology公司。熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國 LI- COR 公司。β-catin購自Bioworld公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購于上海碧云天公司。CCK-8試劑盒購于VICMED公司。AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司。Transwell小室購于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌PC-3細(xì)胞用含10%胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化并按1∶3比例傳代。按細(xì)胞數(shù)為3×105/孔在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%，此時(shí)參考LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染三條SPHK1 siRNA siRNA-1(1 104)：sense 5′-GCAGCUUCCUUGAACCAUUTT-3′,Anti-sense 5′-AAUGGUUCAAGGAAGCUGCTT-3′；siRNA-2(1 603)：sense 5′-GCGUCAUGCAUCUGUUCUATT-3′,Anti-sense 5′-UAGAACAGAUGCAUGACGCTT-3′；siRNA-3(1 813):sense 5′-GUGCACCCAAACUACUUCUTT-3′,Anti-sense 5′-AGAA-GUAGUUUGGGUGCACTT-3′；Negative control：sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,Anti-sense 5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將PC-3細(xì)胞分為空白對(duì)照組(BLANK)、陰性對(duì)照組(negative control,NC)、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組。取100 pmol siRNA稀釋于250 μL、無血清及抗生素的PRMI 1 640培養(yǎng)基中，混勻后室溫中靜置5 min，再以250 μL、無血清及抗生素的PRMI 1 640培養(yǎng)基稀釋5 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，混勻后室溫下靜置5 min，混合稀釋后的siRNA及轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，混勻后放入37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間分別收集細(xì)胞以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)SPHK1基因表達(dá) GenBank檢索目的基因序列，交付上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)并合成引物，序列如下：SPHK1上游引物5′-CCGACGAGGACTTTGTGCTA-3′，下游引物5′-AACCGCTGACCATCCAGAAG-3′，產(chǎn)物長度336 bp。并以GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′,產(chǎn)物長度280 bp。參照TRNzol試劑說明書對(duì)各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，并用分光光度計(jì)測(cè)定A280和A260值，計(jì)算出各組純度及濃度，各組樣品重復(fù)3次。采用天根公司TIANScript RT Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生存所對(duì)應(yīng)的cDNA，按照2×Taq PCR Mastermix(KT201)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，以上循環(huán)25次，再以72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，在UVP圖像處理儀中攝片，利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。SPHK1灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為比較參數(shù)，選取沉默效果最佳的一組siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)各組SPHK1蛋白表達(dá) 選取沉默效果最佳的siRNA作為實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染48 h后，棄凈陳舊培養(yǎng)基后，加入預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入RIPA裂解液，刮取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，SDS-PAGE法進(jìn)行凝膠電泳，待半干后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜，Washing buffer洗膜后，加入二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，避光下再以Washing buffer洗膜后，將NC膜置于Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描板上掃描成像。利用Image J軟件測(cè)定各個(gè)條帶的灰度值，各組間相互比較的參數(shù)為SPHK1條帶灰度值與其相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值的比值。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 根據(jù)設(shè)置的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24、48、72、96 h)取4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每塊96孔板內(nèi)細(xì)胞分為3組：空白組、NC組以及SPHK1-siRNA-1組。轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染24 h后用0.25%胰酶消化各組細(xì)胞，加入含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基并調(diào)整各組濃度為2×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出對(duì)應(yīng)的96孔板，每孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8溶液，小心混勻后再次放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，計(jì)時(shí)后取待測(cè)96孔板放入酶標(biāo)儀測(cè)定儀中，測(cè)定460 nm處吸光度(A)值。計(jì)算各孔平均值，繪制生長曲線。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 按無血清培養(yǎng)基：Matrigel原液=4∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取50 μL加入Transwell小室的上室，置于超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干過夜。收集轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基制備成濃度為2×105/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL均勻鋪至Transwell小室，下室內(nèi)加入含10% FBS的培養(yǎng)基600 μL，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。經(jīng)36 h培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，取出Transwell小室，棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞，加入95%的甲醛固定30 min，再用結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗Transwell小室3遍后，于200倍顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)。1.2.7 AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染方法及步驟同前，6孔板內(nèi)3組細(xì)胞(空白組、NC組、SPHK1-siRNA-1組)轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡各孔內(nèi)陳舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，以1×107/mL的密度重懸細(xì)胞于1×BindingBuffer(含Ca2+)中，取其中100 μL細(xì)胞懸液加入1.5 mL塑料離心管中，分別加入5 μL Annexin及10 μL PI，輕輕混勻后避光孵育15 min，每個(gè)樣品再加入400 μL1×Binding Buffer后于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光)，使用FLowJo7.6軟件分析3組PC-3細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR法半定量檢測(cè)PC3細(xì)胞內(nèi)SPHK1mRNA的相對(duì)表達(dá)量(相對(duì)于內(nèi)參GAPDH mRNA) 由電泳結(jié)果可示實(shí)驗(yàn)組SPHK1 mRNA的表達(dá)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組mRNA表達(dá)量(%)如下：陰性對(duì)照組92.08±1.66，siRNA-1組38.88±2.07，siRNA-2組64.7±3.05，siRNA-3組75.61±2.63，以siRNA-1沉默效果最佳。siRNA-1為本實(shí)驗(yàn)最佳干擾序列，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SPHK1 mRNA的表達(dá)

A:瓊脂糖凝膠電泳圖；B：SPHK1 mRNA表達(dá)率(與BLANK組和NC組比較，*P<0.05；與siRNA-2組和siRNA-3組比較，#P<0.05)。

2.2 Western-blot檢測(cè)SPHK1蛋白表達(dá) 檢測(cè)分析各組Western-blot條帶示，內(nèi)參照GAPDH為均一顯影條帶，實(shí)驗(yàn)組siRNA-1的SPHK1蛋白表達(dá)水平均低于NC組及BLANK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組SPHK1蛋白表達(dá)量(%)如下：NC組89.13±4.43，siRNA-1組38.07±3.56(圖2)。

圖2 Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染各siRNA后細(xì)胞SPHK1蛋白的表達(dá)

A：SDS-PAGE電泳圖；B：SPHK1蛋白表達(dá)率(與BLANK組和NC組比較，*P<0.05)

2.3 沉默SPHK1基因?qū)C-3細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示SPHK1-siRNA-1對(duì)PC-3細(xì)胞有一定的抑制作用，在24、48、72、96 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度與NC組、BLANK組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而NC組與BLANK組相比，差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示PC-3細(xì)胞增殖所受的抑制效果隨時(shí)間延長而增加(表1)。

2.4 沉默SPHK1基因?qū)?xì)胞侵襲力的影響 沉默PC-3細(xì)胞中SPHK1基因后，細(xì)胞在Transwell小室內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)分別如下：BLANK組(192±17)個(gè)/HP，NC組(174±21)個(gè)/HP，siRNA-1組(89±12)個(gè)/HP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果示沉默SPHK1可降低PC-3細(xì)胞的侵襲能力(圖3)。

表1 各組PC-3細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值 (±s，n=3)

BLANK組和NC組比較，*P<0.05; 與BLANK組比較，**P>0.05。

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A、B、C：×200)

A:BLANK組; B:NC組; C:siRNA-1組; D:柱狀圖(與 BLANK組和NC組比較,*P<0.05)。

2.5 沉默SPHK1基因?qū)?xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞結(jié)果示：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PC-3細(xì)胞siRNA-1組凋亡率為(38.8±1.84)%，與BLANK組(19.18±1.63)%和NC組(20.53±1.09)%相比，凋亡率明顯增高(P<0.05)。說明沉默SPHK1基因后的PC-3細(xì)胞凋亡率增加(圖4、圖5)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA沉默SPHK1基因?qū)C3細(xì)胞凋亡的影響

圖5 siRNA沉默SPHK1基因?qū)C-3細(xì)胞凋亡率的影響

與 BLANK組和NC組比較，*P<0.05。

3 討 論

神經(jīng)酰胺/鞘氨醇和S1P是細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)鞘脂的重要代謝產(chǎn)物，它們之間的平衡形成了一個(gè)所謂的“鞘脂變阻器”。而“變阻器”唯一的調(diào)控開關(guān)—鞘氨醇激酶-1(SPHK1)即維持細(xì)胞內(nèi)鞘脂平衡的關(guān)鍵限速酶，通過催化神經(jīng)酰胺以及鞘氨醇來增加胞內(nèi)S1P，以促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[7]。鞘氨醇激酶-1(S1P)活化是由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)解激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)介導(dǎo)，SPHK1通過激活ERK1 / 2 - ETS1和NF-κB通路，上調(diào)相關(guān)啟動(dòng)子活性，過表達(dá)基質(zhì)蛋白金屬酶-1(MMP-1)mRNA和其蛋白水平[8]，使其第225位點(diǎn)上的絲氨酸發(fā)生磷酸化[9]。而MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。SUKOCHEVA等[10]證實(shí)，在人乳腺癌細(xì)胞增殖和生長的過程中，17-β-雌二醇(E2)誘導(dǎo)的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)反式激活是通過由SPHK1控制的一種新穎的信號(hào)系統(tǒng)來驅(qū)動(dòng)；E2刺激SPHK1活化并釋放S1P，后者與細(xì)胞膜表面的特異G蛋白耦聯(lián)受體-內(nèi)皮細(xì)胞分化基因-3(endothelial differentiation gene-3,EDG-3)結(jié)合，導(dǎo)致MMP依賴性的EGFR反式激活，從而調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的遷移信號(hào)[10]。同時(shí)，SPHK1通過增強(qiáng)EGFR磷酸化，促進(jìn)人表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin,EREG)和人雙調(diào)蛋白(amphiregulin,AREG)的上調(diào)，最終增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[11]。

另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在生長因子的作用下，SPHK1易位至胞膜上，通過與生長因子共同機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤形成。非轉(zhuǎn)化的NIH-3T3成纖維細(xì)胞過表達(dá)SPHK1基因完成表型轉(zhuǎn)化，使其不僅在軟瓊脂培養(yǎng)基上大量增殖，并且能夠在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤[12]。研究顯示，SPHK1基因還參與血管生成。在無血清和脫離細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞通過過表達(dá)SPHK1基因從而提高存活率。此外在SPHK1-SPHK2雙缺失的小鼠模型上已證實(shí)，這些激酶是血管發(fā)育和血管發(fā)生不可缺少的[13]。綜合上述結(jié)果表明，SPHK1不僅通過S1P影響腫瘤細(xì)胞本身，而且對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中血管生成所需的細(xì)胞因子等具有協(xié)同或允許作用。這為以SPHK1為靶點(diǎn)治療腫瘤的新型治療策略提供了可靠的依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建靶向SPHK1基因的小干擾片段并沉默SPHK1基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在沉默SPHK1基因后，不僅從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)人前列腺癌PC-3細(xì)胞中相應(yīng)基因mRNA的水平，而且還從翻譯水平下調(diào)PC-3細(xì)胞中SPHK1蛋白的表達(dá)量。說明SPHK1基因不僅在PC-3細(xì)胞中表達(dá)，而且SPHK1-siRNA抑制了該基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，采用CCK-8法檢測(cè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的A值，與空白組以及陰性對(duì)照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞增殖被抑制，生長減緩。通過模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)表明沉默SPHK1基因可明顯對(duì)PC-3細(xì)胞的穿膜、侵襲能力抑制。為進(jìn)一步了解沉默SPHK1基因?qū)C-3細(xì)胞的影響，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組PC-3細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示siRNA干擾組的凋亡率明顯高于其他2組。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，通過利用RNA干擾技術(shù)沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞SPHK1基因，下調(diào)該基因在細(xì)胞中表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞的增殖、侵襲能力，同時(shí)提高細(xì)胞凋亡率。這些生物學(xué)行為的改變可能與SPHK1參與的腫瘤發(fā)生中血管的形成等機(jī)制有關(guān)。通過本次實(shí)驗(yàn)，有望為今后深入研究SPHK1基因與前列腺癌打下基礎(chǔ)，并為未來基因靶向治療前列腺癌提供新的思路。

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(編輯 王 瑋)

Effects of SPHK1 RNAi on prostate cancer PC-3 cells

LI Xiang1, SHI Zhan1, MA Rui-ning1, SUN Xiao-qing2

(1. Xuzhou Medical College; 2. Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China)

Objective To investigate the effects of silencing of sphingosine kinase-1 (SPHK1) gene expression by siRNA on the biological behavior of human prostate cancer PC-3 cells. Methods Lipofectamine 2000 (Lipo) was used to transfect the siRNA targeting SPHK1 gene into PC-3 cells. The expression of SPHK1 was examined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western-blot. The change of proliferation was detected by CCK-8.The apoptosis was investigated by Annexin V-PI. The activities of motility and invasion was assessed by Transwell chamber invasion assay in vitro. Results The expression levels of SPHK1 mRNA and protein in the cells transfected with siRNA were significantly lower than in blank group and in negative control (NC) group (P<0.05). The proliferation of PC-3 cells was remarkable inhibited, the invasion was decreased, and apoptosis was increased. Conclusion The inhibition of SPHK1 gene expression by siRNA could inhibit cells from proliferation, reduce invasion and increase apoptosis, which suggest that SPHK1 gene plays a key role in the pathogenesis and development of prostate cancer.

RNA interference; prostate cancer; sphingosine kinase-1; proliferation; apoptosis

2015-01-08

2015-05-05

孫曉青，教授，主任醫(yī)師.E-mail：sunheyao@126.com

李想(1989-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)碩士.研究方向：前列腺癌的基因治療.E-mail：jerryideal@sina.com

R737.25

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.09.015