林明 楊自力

目前認為，促炎與抗炎反應失衡為誘導急性肺損傷發(fā)生的根本原因，但目前對促炎與抗炎反應失衡準確評估有較大難度。大量研究表明，T輔助淋巴細胞可反映機體炎癥反應的免疫功能狀態(tài)，其功能變化在急性肺損中的作用較大[1]。為了探討T輔助淋巴細胞的功能變化在急性肺損傷中的意義，本文選取100只小鼠作為研究對象進行分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗小鼠均為野生鼷鼠的變種，來源于野生的小家鼠，選取100只小鼠作為研究對象。采用隨機數(shù)字表法將其分成觀察組和對照組，每組50只，雌雄各半，體重20~24 g。兩組小鼠的一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 小鼠處理 首先為觀察組小鼠進行適量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔處，7.5 h之后再為小鼠注射適量的甲酰基-苯丙氨酸，然后進行急性肺損傷小鼠基本模型的制作，等到大約3.5 h之后將小鼠處死；對照組小鼠則進行適量生理鹽水的簡單注射，注射的量和觀察組小鼠藥物注射量相同。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 在對小鼠進行有效處理之后，按照相關要求進行小鼠脾細胞的正常分離，適量增添細胞培養(yǎng)液，利用顯微鏡觀察小鼠脾細胞的數(shù)量，然后對小鼠脾細胞進行稀釋處理，最終使其量控制在10×106個左右，加入適量的刀豆素，使其濃度控制在1.1 μg/mL左右，溫室溫度下及4.5%濃度的二氧化碳的環(huán)境下進行細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)的時間在70 h左右，培養(yǎng)結(jié)束之后，留取細胞上清液，檢測上清液中的IFN-γ濃度及IL-4濃度，最后提取脾細胞中的RNA。

1.2.3 濃度測定 在檢測細胞當中的相關因子濃度時，需要用到IFN-γ酶的專門吸附盒和IL-4酶的專門吸附盒，按照吸附盒上面的具體要求進行細胞測定，利用酶標儀對波長500 nm的位置進行密度檢測，按照標準曲線的變化規(guī)律，最終確定小鼠細胞當中的具體因子濃度。

1.2.4 基因表達數(shù)量計算 利用PCR的標準測定試劑盒，進行小鼠脾細胞當中的基因轉(zhuǎn)錄，使其最終合成cDNA，然后進行PCR的有效擴增。對引物序列進行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它們分別有各自的上游引物和下游引物。經(jīng)過對引物圖像的觀察和分析進行產(chǎn)物測量，對三大序列產(chǎn)物進行正常掃描，確定出具體的光密度數(shù)值，最后進行三大序列引物光密度數(shù)值的相互對比，從而測得基因表達。

1.2.5 損傷指標檢測 首先進行肺組織含水量的正常檢測，在處死小鼠以后，把小鼠的右肺進行有效割除，進行表面水清除之后進行肺組織稱重，稱重之后放到專門烘箱當中進行有效烘干后稱重；然后進行漏出量的具體檢測，在小鼠腹腔當中進行藥物注射，處死小鼠之后利用專用針進行小鼠右心室的有效穿刺，利用適當濃度的生理鹽水進行小鼠肺部的清洗，使其完全干凈，切除小鼠的肺部相關組織，對肺門組織進行正常稱重，進行小鼠肺組織的孵育，孵育的時候要添加適量的甲酰胺，收集其浸出的液體，進行液體吸光值的具體有效計算。對照組小鼠確定伊文思藍的具體濃度值；最后進行小鼠肺組織的有效觀察，進行肺下葉的正常染色，觀察其病理變化情況，利用相關分析軟件確定出細胞PMN的平均值。

1.3 觀察項目和指標 （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾細胞中IFN-γ的基因表達能力[2]。

1.4 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

觀察組小鼠上清液中IFN-γ的含量明顯低于對照組，IL-4含量明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），觀察組小鼠體內(nèi)脾細胞中IFN-γ基因表達能力明顯低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ基因表達能力比較（x-±s）

3 討論

急性肺損傷是一種各種致病因素引發(fā)的廣泛肺泡毛細血管損傷，以致炎因子釋放、中性粒細胞浸潤、廣泛肺泡毛細血管損傷為特征，臨床以難以糾正的低氧血癥及進行性呼吸困難為主要表現(xiàn)，急性嚴重肺損傷，在臨床被定義為急性呼吸窘迫綜合征[3]。如何對肺損傷過程中肺泡受損毛細血管保護并修復，是肺保護的重點。ALI的發(fā)生發(fā)展，由機體過度炎癥反應參與介導[4]。危重病醫(yī)學會在2001年將機體過度炎癥反應定義為全身炎癥反應綜合征，其后果為破壞機體自身組織。機體內(nèi)源性抗炎癥反應伴隨炎癥反應的發(fā)生，呈增強趨勢[5]。Bone等[6]將此種抗炎癥反應按抗炎癥反應綜合征概括，其引發(fā)的后果是膿毒癥及免疫功能低下，故不管哪方占優(yōu)勢，ALI病發(fā)中，促炎及抗炎反應失衡均為本質(zhì)原因。故針對檢測的促炎、抗炎反應失衡的程度和方向，應用不同的措施干預，使雙方動態(tài)平衡恢復，是對ALI防治的關鍵。但對促炎、抗炎雙方平衡的相關性評價，目前臨床尚無有效評估指標。有研究顯示，Th細胞，可反映雙方平衡關系，Th1細胞以對促炎細胞因子分泌為特征，與促炎反應有密切相關性；Th2細胞以對抗炎細胞因子分泌為特征，與抗炎反應有密切相關性[7-9]。IFN-γ、IL-4為特征性細胞因子，分別由Th1、Th2細胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情況。

有研究示，取LPS、FNLP經(jīng)腹腔注射后，肺濕重與干重比、肺伊文斯藍浸出量、肺病理改變均提示成功建立ALI模型[10]。對脾細胞中IL-4、IFN-γ變化進行觀察，結(jié)果相較對照組，BLAB/C小鼠在ALI時，脾細胞中IFN-γ呈近60%的下降，而檢測IL-4，呈4倍多的升高。此與蔣雄斌等[10]報道一致，但IL-4升高更為明顯。

IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡變化的典型細胞因子，此種變化表明，在ALI發(fā)生時，Th1漂移至Th2。目前研究顯示，Th1飄移至Th2，與下列因素可能相關。（1）LPS結(jié)合單核巨噬細胞表面CD14受體，對TNFα、IL-1等炎癥細胞因子釋放，同時伴隨大量抑制介質(zhì)前列腺素E2的釋放，經(jīng)PGF2依賴性通道，促使Th細胞向Th2表型明確轉(zhuǎn)化。PGE2可對Th1合成IFN-γ、IL-2明顯抑制，卻對Th2生成IL-4不影響[11]。（2）與炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1、TNF-α的釋放伴發(fā)，糖皮質(zhì)激素有增加表現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可對Th1細胞核轉(zhuǎn)錄抑制因子合成增加產(chǎn)生刺激，此因子與核因子結(jié)合，促使復合物形成，從而對炎癥細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄阻止[12]。此外，糖皮質(zhì)激素，可影響炎癥細胞因子相關基因轉(zhuǎn)錄。

對脾細胞中的IFN-γmRNA表達進一步觀察得出，ALI時IFN-γmRNA表達下降明顯，IL-4m RNA表達量顯著升高。提示ALI時，可在mRNA水平上使促炎細胞因子IFN-γ的表達抑制，抗炎細胞因子IL-4的表達增加，從而引發(fā)促炎、抗炎失衡。

Th1向Th2飄移，表明抗炎癥反應在ALI發(fā)生時，呈增強趨勢，而抗炎癥反應的增強，誘導機體細胞免疫功能出現(xiàn)低下。故可通過對Th1、Th2平衡變化檢測，選擇適當?shù)臅r機，針對免疫功能低下，采

取有效的免疫調(diào)節(jié)措施，使促炎、抗炎平衡恢復，對ALI進行防治。促炎與抗炎反應失衡，為誘導急性肺損傷發(fā)生的本質(zhì)原因，對促炎與抗炎反應失衡準確評估有較大難度[13]。T輔助淋巴細胞可反映機體炎癥反應的免疫功能狀態(tài)。

在受到嚴重的創(chuàng)傷之后，傷口是容易感染的，而在感染之后，傷口處容易出現(xiàn)各種病毒和細菌，會嚴重損害人們的身體健康。相關研究結(jié)果證明，急性肺損傷與體內(nèi)炎癥反應不平衡相關，會導致機體促炎、抗炎反應不平衡[14]。機體內(nèi)各類脾細胞當中，存在很多促炎細胞和抗炎細胞，比如干擾素和白介素等，只有保證這兩種因子平衡，才能保證兩種細胞平衡[15]。當發(fā)生急性肺損傷，機體炎癥反應規(guī)律是不明確的，各種細胞的反應情況也是不明確的，本文主要通過對急性肺損傷小鼠的功能試驗研究，反應急性肺損傷機體炎癥反應情況。

相關研究結(jié)果表明，在急性肺損傷研究當中，觀察機體炎癥反應是比較重要的，因為在肺損傷的過程中，會產(chǎn)生傷口感染從而引起傷口炎癥出現(xiàn)[16]。因此，通過肺損傷相關部位抗炎反應及能力的檢測和觀察，就可以判斷急性肺損傷病情。本文主要通過小鼠淋巴細胞試驗，對小鼠急性肺損傷的相關平衡因子和基因表達功能進行檢測，最終發(fā)現(xiàn)，機體抗炎反應在急性肺損傷中的作用非常大，而T輔助淋巴細胞對小鼠體內(nèi)這種抗炎反應的調(diào)節(jié)和控制作用也比較大，在急性肺損傷疾病臨床研究中的意義比較大。急性肺損傷機體抗炎反應主要表現(xiàn)為單核細胞的有效受體結(jié)合、抗炎因子的生成和細胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4兩大因子的有效合成和轉(zhuǎn)化、IL-10因子的生成和增加、糖皮質(zhì)激素的不斷增加及脾細胞因子的異常轉(zhuǎn)錄等[17]。經(jīng)過對小鼠體內(nèi)T輔助淋巴細胞功能變化的有效觀察可以判斷急性肺損傷小鼠的病理學變化情況，急性肺損傷小鼠脾細胞mRNA表達能力比正常小鼠弱很多，證明抗炎反應是導致急性肺損傷的主要原因。

本研究結(jié)果表明觀察組小鼠上清液當中IFN-γ的含量明顯比對照組低，IL-4含量卻比對照組高，且經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄測定結(jié)果顯示，觀察組小鼠體內(nèi)脾細胞IFN-γ基因表達能力明顯比對照組低，以上比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明當發(fā)生急性肺損傷后，小鼠會產(chǎn)生明顯的抗炎癥反應，T輔助淋巴細胞的功能變化在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用比較大。

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