孫晶，高珂，王玲，吳素瑞，楊洪一，隋春

1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.東北林業(yè)大學 生命科學院，黑龍江 哈爾濱 150040；

3.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科柴胡屬植物，是《中華人民共和國藥典》（2010年版）規(guī)定的藥用柴胡基源植物之一，以根入藥。柴胡皂苷為其主要藥效成分，包括柴胡皂苷A、C和D。柴胡皂苷在鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、保肝等方面起重要作用[1]，同時也是鑒定柴胡原藥材質(zhì)量的重要標準[2]。毛狀根培養(yǎng)是20世紀80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結(jié)合的一項技術(shù)，通過將發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）中Ri質(zhì)粒含有的T-DNA整合到植物細胞的DNA上，誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生毛狀根。毛狀根具有生長迅速、激素自養(yǎng)、生長條件簡單、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定、分化程度高、不易變異等特點[3-4]。通過優(yōu)化毛狀根液體培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分，可以增強毛狀根合成天然活性成分的能力，甚至合成原植物沒有的、生理活性更強的天然藥物成分[5]。目前為止，毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)已應(yīng)用于丹參（Salvia miltiorrhiza）[6-7]、人參（Panax ginseng）[8]、黃芩（Scutellaria baicalensis）[9]、青蒿（Artemisia annua）[10]和金鐵鎖（Psammosilene tu?nicoides）[11]等多種藥用植物。我們對北柴胡毛狀根培養(yǎng)中的培養(yǎng)基、外源激素和真菌誘導(dǎo)子等進行了優(yōu)化，為北柴胡毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從本實驗室前期誘導(dǎo)獲得的北柴胡毛狀根中選取一個長勢優(yōu)良的株系作為實驗材料。切取1～1.5 cm長的毛狀根根尖，每50條為一份，接種于250 mL錐形瓶（裝有100 mL培養(yǎng)液）中?；九囵B(yǎng)條件：B5液體培養(yǎng)基（pH5.7），添加20 g/L蔗糖，暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min，培養(yǎng)溫度為25±2℃，每15 d繼代一次，繼代第3次后第10 d取樣。

1.2 培養(yǎng)基、外源激素和真菌誘導(dǎo)子處理條件

實驗設(shè)置如下多個不同培養(yǎng)條件處理組：①培養(yǎng)基3種，即B5、改良White和WPM，3種培養(yǎng)基均以濃度為20 g/L的蔗糖作為碳源，pH值分別為5.8、5.6和5.7[12]。②外源激素3種，3-吲哚丁酸（IBA）濃度設(shè)置為0.2、0.5、1.0、3.0 mg/mL，吲哚-3-乙酸（IAA）濃度設(shè)置為0.2、0.5、1.0 mg/mL，6-芐氨基嘌呤（6-BA）濃度設(shè)置為 0.2、3.0 mg/mL。③黑曲霉誘導(dǎo)子的制備和篩選：黑曲霉（Aspergillus niger，由中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所提供）接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基中含葡萄糖2 g、20%馬鈴薯浸汁100 mL）中，于搖床上120 r/min、25℃、暗培養(yǎng)3 d收獲，將懸浮培養(yǎng)的菌球抽濾，加入10倍體積的蒸餾水稀釋，勻漿液于高壓滅菌，再抽濾，濾液即為可供使用的真菌誘導(dǎo)子[13]。每50 mL B5培養(yǎng)基中分別添加1.0、1.5、2.0、2.5 mL黑曲霉真菌誘導(dǎo)子。

以上每種處理均接種3瓶，培養(yǎng)3個月收獲，測定毛狀根干重和皂苷含量。

1.3 產(chǎn)量與含量測定分析

將收獲的毛狀根用蒸餾水清洗4次，用無菌濾紙吸除表面多余水分，42℃烘干48 h，測其干重。以干重為毛狀根產(chǎn)量衡量標準，皂苷產(chǎn)量（μg）=（皂苷含量×收獲后干重[14]）。

1.3.1 總皂苷提取方法 稱取干燥的毛狀根粉末1 g置于100 mL三角瓶中，用50 mL 5%氨水甲醇溶液超聲波提取40 min，抽濾，70℃水浴蒸干后，用色譜甲醇定容至5 mL容量瓶，用0.45 μm微孔濾膜過濾[15]。

1.3.2 HPLC 條件 ASB-vensil C 18 色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為水/0.05%NH4OH，B為乙腈，流速1.50 mL/min；用LC parameters檢測，柱溫40±0.15℃，指紋圖譜梯度運行時間27 min，進樣量 20 μL。梯度洗脫程序：0～15 min，10%～85%（B）；15～18 min，85%～85%（B）；18～22 min，85%～10%（B）；22～27 min，10%～10%（B）。

1.3.3 幾種單體皂苷標準曲線的繪制 分別稱取柴胡皂苷A、C和D，用色譜甲醇定容成標準品溶液，再配成混合的標準品溶液，以進樣濃度C對峰面積進行線性回歸，得到各單體皂苷的回歸方程。皂苷A：y=1.4097x+16.4560，R2=0.9984，在 0.05～1.0 g/L 線性關(guān)系良好；皂苷C：y=1.4182x+16.4145，R2=0.9995，在0.05～1.0 g/L 線性關(guān)系良好；皂苷 D：y=1.4366x+16.3654，R2=0.9991，在 0.05～1.0 g/L 線性關(guān)系良好。采用上述色譜條件測定各樣品柴胡皂苷峰面積，根據(jù)回歸方程計算柴胡皂苷A、C和D的含量。

2 結(jié)果

2.1 3種培養(yǎng)基篩選結(jié)果

3種基本培養(yǎng)基對毛狀根產(chǎn)量的影響見圖1A，北柴胡毛狀根在B5液體培養(yǎng)基中生長效果最好，毛狀根干重最高，為2.065 g。在柴胡皂苷合成和積累方面，如圖1B所示，B5培養(yǎng)基處理組的柴胡總皂苷含量最高，為991.95 μg/g，改良White次之。但圖1C表明，B5處理組的柴胡單體皂苷并不是都高于其他處理組，其中B5處理組柴胡皂苷C、A和D含量分別為 130.44、534.0 和 318.54 μg/g，改良 White處理組中柴胡皂苷 D含量為 419.17 μg/g，高于 B5處理組，這也表明不同培養(yǎng)基對柴胡毛狀根單體皂苷合成和積累存在不同影響。此外，分析HPLC數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)改良White處理組重復(fù)間差異很大，較不穩(wěn)定。綜合毛狀根產(chǎn)量和柴胡總皂苷產(chǎn)量（圖1D），B5培養(yǎng)基處理組的總皂苷含量和產(chǎn)量都最高，分別為991.95 μg/g和2.048 mg。因此，選定B5為柴胡毛狀根液體培養(yǎng)基本培養(yǎng)基。

2.2 激素對北柴胡毛狀根生長和柴胡皂苷含量的影響

在B5培養(yǎng)基中分別添加激素IAA、IBA、6-BA，均能促進北柴胡毛狀根的生長，3種外源激素對毛狀根生長的促進作用沒有明顯的區(qū)別。由圖2A可知3種激素的最適宜濃度：在添加IBA的培養(yǎng)基中生長量較高，其中濃度為0.5 mg/L的IBA可使毛狀根產(chǎn)量最高，干重為2.4 g；濃度為0.2 mg/L的6-BA對毛狀根的生長影響次之，干重為2.28 g；濃度為1.0 mg/L的IAA，毛狀根干重為2.27 g。在加入激素6-BA的處理組中，發(fā)現(xiàn)毛狀根有顯著的增粗現(xiàn)象，且在生長側(cè)根處變得粗大，呈圓球形，毛狀根顏色呈淺黃色，與其他2組生長狀況略有不同。

圖1 3種基本培養(yǎng)基對北柴胡毛狀根生長和皂苷含量的影響A：毛狀根干重；B：柴胡總皂苷含量；C：柴胡單體皂苷含量；D：柴胡總皂苷產(chǎn)量

圖2 IBA、IAA和6-BA對北柴胡毛狀根生長和柴胡皂苷含量的影響A：毛狀根干重；B：柴胡總皂苷含量；C：柴胡單體皂苷含量；D：柴胡總皂苷產(chǎn)量

外源激素處理對北柴胡毛狀根皂苷合成和積累具有一定影響，不同激素處理組中皂苷含量存在較明顯差異。通過測定，IBA、IAA和6-BA對北柴胡毛狀根的柴胡皂苷合成均有促進作用。其中，IBA和6-BA處理組柴胡總皂苷含量明顯高于IAA處理組（圖2B），且6-BA對皂苷合成的影響略高于IBA。通過HPLC檢測，6-BA濃度為0.2 mg/L時，柴胡皂苷C、A 和 D 的含量最高，分別為 357.76、1892.46和1924.37 μg/g；IBA 濃度為 0.5 mg/mL 時，柴胡皂苷C、A 和 D 的含量次之，分別為 498.15、1631.84和1644.52 μg/g（圖2C）。激素處理組中柴胡總皂苷產(chǎn)量最高的是 6-BA（0.2 mg/L），產(chǎn)量為9.51 mg；IBA（0.5 mg/L）處理組略低，含量為9.05 mg（圖2D）。2組處理的總皂苷含量較相近，但實驗中發(fā)現(xiàn)6-BA（0.2 mg/L）處理組較不穩(wěn)定，且后期毛狀根大多數(shù)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，較IBA處理組更易衰老（圖3）。因此，綜合考慮既可以提高北柴胡毛狀根的生產(chǎn)量，又可以增加毛狀根中皂苷的積累，選定濃度為0.5 mg/mL的IBA為最適激素條件。

2.3 真菌誘導(dǎo)子對北柴胡毛狀根生長和柴胡皂苷含量的影響

圖3 IBA和6-BA對北柴胡毛狀根生長的影響A：IBA（0.5 mg/mL）處理組毛狀根生長狀況；B：6-BA（0.2 mg/L）處理組毛狀根生長狀況

選用黑曲霉作為真菌誘導(dǎo)子，對北柴胡毛狀根的生長沒有促進作用，加入真菌誘導(dǎo)子1.0 mL時（圖4A），真菌誘導(dǎo)子組毛狀根產(chǎn)量最高，為1.15 g，比B5培養(yǎng)基處理組少0.91 g。這表明黑曲霉真菌誘導(dǎo)子對北柴胡毛狀根生長存在一定的抑制作用。如圖4B所示，HPLC測定毛狀根中柴胡總皂苷含量結(jié)果，在真菌誘導(dǎo)子濃度為1.0 mL/mL時總皂苷含量最高，為898.09 μg/g，該處理組柴胡皂苷A、C和D的含量也均最高，分別為93.15、364.19和317.41 μg/g（圖4C），比增值倍數(shù)相同的B5培養(yǎng)基總皂苷含量高30.76%。綜合考慮，真菌誘導(dǎo)子對毛狀根生長具有一定的抑制作用，但可以有效促進柴胡皂苷的合成。在相同接種量和培養(yǎng)時間下，真菌誘導(dǎo)子處理組比B5處理組總皂苷產(chǎn)量下降了47.8%（圖4C、D）。因此，在柴胡毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)中，為得到更高的柴胡皂苷產(chǎn)量，不適合添加黑曲霉真菌誘導(dǎo)子。

綜上所述，選定北柴胡毛狀根培養(yǎng)條件為：添加0.5 mg/L IBA的B5液體培養(yǎng)基，毛狀根產(chǎn)量和柴胡皂苷產(chǎn)量較高，毛狀根干重為2.4 g，總皂苷產(chǎn)量為9.05 mg。

3 討論

圖4 黑曲霉真菌誘導(dǎo)子對北柴胡毛狀根生長和柴胡皂苷含量的影響A：毛狀根干重；B：柴胡總皂苷含量；C：柴胡單體皂苷含量；D：柴胡總皂苷產(chǎn)量

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根體系已在26科96種藥用植物中得到研究[16]。但是，不同植物毛狀根培養(yǎng)條件有很大差異，對于每種植物的培養(yǎng)方法沒有固定模式可循，需要針對植株特性來摸索出最適宜的培養(yǎng)條件[17-20]。北柴胡毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化還未見報道。本實驗表明，在北柴胡毛狀根液體振蕩培養(yǎng)中，選擇添加濃度0.5 mg/L IBA的B5培養(yǎng)基，毛狀根產(chǎn)量和柴胡皂苷產(chǎn)量較好，毛狀根干重為2.4 g，總皂苷產(chǎn)量為9.05 mg。

本實驗表明，在北柴胡毛狀根B5培養(yǎng)基中添加不同濃度的黑曲霉真菌誘導(dǎo)子，對毛狀根生長有抑制作用，對總皂苷的合成有促進作用，但其抑制作用大于促進作用。這與劉俊等[21]報道的黑曲霉誘導(dǎo)子既對人參毛狀根皂苷合成起促進作用，又可促進人參毛狀根的生長不一致。體現(xiàn)出同樣的真菌誘導(dǎo)子對不同植物毛狀根的生長作用不同，但都能促進皂苷類成分合成[22-23]。因此，毛狀根大規(guī)模生產(chǎn)中，對真菌誘導(dǎo)子的選擇需要進行實驗驗證。

總之，我們通過改變培養(yǎng)基、外源激素和真菌誘導(dǎo)子等因素提高了北柴胡毛狀根的產(chǎn)量和皂苷的含量，將為北柴胡毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)及活性成分的積累提供借鑒。

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