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        順鉑聯(lián)合鴉膽子油乳對(duì)人卵巢癌裸鼠原位移植瘤生長(zhǎng)的影響

        2015-11-29 04:16:20趙楠韓鳳娟王桂媛李玉花
        生物技術(shù)通訊 2015年4期
        關(guān)鍵詞:油乳鴉膽子原位

        趙楠,韓鳳娟,王桂媛,李玉花

        1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040

        順鉑是中心以二價(jià)鉑同2 個(gè)氯原子和2 個(gè)氨分子結(jié)合的重金屬絡(luò)合物,具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用,可抑制DNA的復(fù)制過(guò)程,高濃度時(shí)抑制RNA及蛋白質(zhì)合成。臨床上順鉑可以與多種抗腫瘤藥協(xié)同作用,且無(wú)交叉耐藥特點(diǎn),為當(dāng)前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一,一般多用于生殖系統(tǒng)腫瘤如卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌,頭頸部癌如鼻咽癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌,對(duì)肺癌、乳腺癌等也有一定的功效。鴉膽子油乳由中藥鴉膽子[Brucea javanica(L.)Merr.]干燥的成熟果實(shí)提取的脂肪油經(jīng)乳化作用制成,其主要活性成分油酸及亞油酸具有很強(qiáng)的抗癌活性,與腫瘤細(xì)胞膜有特異的親和力[1],能抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成。研究表明,鴉膽子油乳作為臨床應(yīng)用較廣的一種中藥,對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡的作用,并可逆轉(zhuǎn)多種癌細(xì)胞的多藥耐藥,臨床上多采用鴉膽子油乳作為逆轉(zhuǎn)劑與常用抗癌藥合用治療產(chǎn)生耐藥性的腫瘤。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        BALB/c(nu/nu)裸小鼠,雌性,鼠齡4~8 周,體重18~22 g,SPF 級(jí),購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào):11400700054740],恒溫(25℃±2℃)、恒濕(45%~50%)飼養(yǎng)于無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室的凈化空氣層流架中。人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;鴉膽子油乳劑購(gòu)自浙江九旭藥業(yè)公司,10 mL/支;順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥廠,50 mL/支;新生胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma 公司;二甲亞颯(DMSO)購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠;DAB 顯色試劑盒、兔抗人整合素α5、MRP-1/CD9免疫組化試劑盒、免疫組化SP 試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

        1.2 人卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

        人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中,在98%相對(duì)濕度、37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。常規(guī)消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),讀出細(xì)胞濃度,將細(xì)胞分裝入離心管,12 000 r/min 離心5 min,去其上清液,并調(diào)整細(xì)胞濃度為(1~3)×107/mL。

        1.3 腫瘤動(dòng)物模型的建立

        常規(guī)消毒裸鼠,將濃度為1×107/mL 的SKOV3 細(xì)胞0.2 mL 注射于裸鼠后背部皮下,待接種成功的原代接種瘤生長(zhǎng)至直徑1~1.5 cm,頸椎脫臼法處死裸鼠,剝?nèi)∑は履[瘤浸入4℃的生理鹽水中漂洗,并切成1 mm3大小。常規(guī)麻醉、消毒裸鼠,將準(zhǔn)備好的皮下腫瘤組織小塊小心放置在卵巢破口深處,滴注適量醫(yī)用生物蛋白膠固定,觀察有無(wú)出血,逐層關(guān)腹。

        1.4 動(dòng)物給藥及處理

        裸鼠接種2 周后,測(cè)得裸鼠的體重為18~24 g,給予藥物干預(yù)。用隨機(jī)數(shù)字表將32 只裸鼠完全隨機(jī)分為4組,每組8只,分別為空白對(duì)照組、鴉膽子油乳組、順鉑組和鴉膽子油乳順鉑聯(lián)合組??瞻讓?duì)照組給予生理鹽水0.2 mL/只,鴉膽子油乳組給予鴉膽子油乳0.2 mL/20 g,順鉑組給予順鉑0.2 mL(按3 mg/kg計(jì)算),聯(lián)合組給予鴉膽子油乳注射液0.2 mL/20 g 加順鉑0.2 mL。每隔3 d 給藥1 次,共計(jì)腹腔給藥6次。

        1.5 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

        1.5.1 移植瘤裸鼠生長(zhǎng)情況 每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、排便、對(duì)外界的反應(yīng)等,以及移植瘤表面有無(wú)紅腫及破潰面,其大小、形態(tài)、質(zhì)地、硬度、活動(dòng)度,并觸及有無(wú)搏動(dòng)。

        1.5.2 移植瘤生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定 ①腫瘤體積測(cè)量:移植瘤裸鼠處死后剝瘤塊取出腫瘤組織,電子天平稱重,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑(a/mm)與最短徑(b/mm),根據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積。②腫瘤抑制率檢測(cè):腫瘤抑瘤率(%)=(1-治療組腫瘤組織平均重量/空白組腫瘤組織平均重量)×100%。③相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)的計(jì)算:相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)=(TRTV/CRTV)×100%。TRTV 為治療組相對(duì)腫瘤體積,CRTV為陰性對(duì)照組相對(duì)腫瘤體積,RTV(相對(duì)腫瘤體積)=V/V0(V0為給藥前腫瘤體積,V為處死前腫瘤體積)。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):T/C>60%為無(wú)效;T/C≤60%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05為有效。

        1.5.3 血細(xì)胞指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后將各組裸鼠眼眶取血后處死,收集血液于EP 管中,加入肝素抗凝劑,取300μL用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞及血小板數(shù)目;取500μL 靜置30 min,離心取血清,檢測(cè)各組裸鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、血肌酐(CR)的變化。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用x±s 表示,進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性分析,兩組間均數(shù)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),兩組用藥前后使用配對(duì)t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析,組間比較采用多重比較LSD 法。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05 視為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 SKOV3裸鼠移植瘤模型的建立

        觀察發(fā)現(xiàn),一般接種2~3 d 后裸鼠后背即可出現(xiàn)界限清晰、質(zhì)地柔軟的“假瘤樣”皮下結(jié)節(jié);1~2 周后部分移植瘤表面出現(xiàn)破潰,部分可見(jiàn)血管;當(dāng)移植瘤直徑達(dá)1.5 cm 后,腫瘤生長(zhǎng)速度逐漸減慢,裸鼠精神萎靡、消瘦、厭食、怕光、煩躁,一般生存期為37~42 d。

        2.2 卵巢癌SKOV3原位腫瘤的形成

        移植原位腫瘤后常規(guī)飼養(yǎng)裸鼠。一般可見(jiàn),移植28 d 后原位腫瘤生長(zhǎng)速度減慢,荷瘤鼠逐漸表現(xiàn)出消瘦、萎靡、厭食等癥狀。剖腹探查原位腫瘤的形成,發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑為1.0~2.0 cm,有1 只發(fā)生腸系膜腹腔轉(zhuǎn)移。見(jiàn)圖1。

        2.3 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響

        給藥前各組裸鼠腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著治療天數(shù)的增加,治療結(jié)束后,各組裸鼠腫瘤體積產(chǎn)生明顯差異,各治療組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01),說(shuō)明鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組均可有效遏制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(表1)。

        2.4 不同藥物對(duì)SKOV3 裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較

        鴉膽子油乳組、順鉑組、聯(lián)合組的抑瘤率分別為23.56%±3.67%、42.57%±3.45%、48.36%±3.08%,聯(lián)合組的抑瘤率明顯高于鴉膽子油乳組和順鉑組,可以有效遏制腫瘤組織的生長(zhǎng)(表2)。

        2.5 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤體積、RTV 與T/C的影響

        腹腔注射給藥后,鴉膽子油乳組、順鉑組與聯(lián)合組腫瘤體積、RTV和T/C 明顯下降,T/C 均低于60%,根據(jù)抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則中的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),揭示其體內(nèi)抗腫瘤活性較強(qiáng),且與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

        2.6 不同藥物對(duì)SKOV3 裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響

        通過(guò)檢測(cè)裸鼠血小板和白細(xì)胞數(shù)量來(lái)觀察各治療組的變化,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,鴉膽子油乳組血小板、白細(xì)胞數(shù)量均減少,其中血小板的減少差異不顯著(P>0.05),而白細(xì)胞數(shù)量減少的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而順鉑組、聯(lián)合組的血小板、白細(xì)胞數(shù)量均明顯減少,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表4)。

        2.7 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠肝腎功能的影響

        與空白對(duì)照組比較,鴉膽子油乳組治療后裸鼠ALT 值無(wú)顯著差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),LDH、CR 值差異顯著(P<0.01);與鴉膽子油乳組比較,順鉑組與聯(lián)合組的ALT、LDH、CR 值均有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表5)。

        表1 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響(n=8,)

        表1 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤體積的影響(n=8,)

        表2 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較(n=8,)

        表2 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠移植瘤重量的抑制作用及抑瘤率比較(n=8,)

        表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值(n=8,)

        表3 不同給藥組裸鼠瘤體積的RTV及T/C值(n=8,)

        圖1 原位腫瘤的形成(A)、形態(tài)(B)、大?。–)、正面形態(tài)(D)及腸系膜轉(zhuǎn)移(E)

        表4 不同藥物對(duì)SK0V3裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響(n=8,)

        表4 不同藥物對(duì)SK0V3裸鼠白細(xì)胞及血小板的影響(n=8,)

        表5 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠肝腎功能的影響(n=8,)

        表5 不同藥物對(duì)SKOV3裸鼠肝腎功能的影響(n=8,)

        3 討論

        卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤第三位,死亡率居于婦科惡性腫瘤之首,五年生存率為15%~30%[2-3],嚴(yán)重威脅著女性健康及生命。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、鉑類化療藥物和紫杉醇聯(lián)合化療的綜合治療,仍是目前臨床上治療卵巢癌的主要方式。上世紀(jì)60 年代開(kāi)始采用腹腔灌注化療治療卵巢癌,主要針對(duì)患者術(shù)后殘余及腹腔轉(zhuǎn)移的病灶進(jìn)行治療,可以有效清除游離癌細(xì)胞及微小癌灶,防治術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)及肝臟轉(zhuǎn)移,提高患者生存率,改善生存質(zhì)量。

        我們的前期體外實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑可以抑制人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)其凋亡。隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈上升趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上,我們將體外實(shí)驗(yàn)引入體內(nèi),將腫瘤細(xì)胞懸液皮下注射成瘤后,取成型的皮下腫瘤進(jìn)行組織塊原位移植,建立人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型,分組給予藥物干預(yù),進(jìn)一步觀察鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。

        3.1 人卵巢癌SKOV3裸鼠原位移植瘤模型的建立

        自1969年丹麥學(xué)者Rygaard和Povlsen首次建立了人結(jié)腸癌組織裸鼠皮下移植瘤模型后,裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)技術(shù)日臻完善。裸鼠移植瘤模型成為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、檢測(cè)抗腫瘤藥物的敏感性、研發(fā)新型抗腫瘤藥物的有效實(shí)驗(yàn)手段[4]。卵巢癌裸鼠移植瘤模型按腫瘤的來(lái)源不同,可以分為切除標(biāo)本實(shí)體瘤和卵巢癌細(xì)胞株;按接種部位的不同,可以分為皮下移植裸鼠模型、腹腔種植裸鼠模型和裸鼠體內(nèi)原位移植模型[5]。

        1993 年Fidler 建立了第一個(gè)人卵巢癌原位移植模型,該方法保留了人腫瘤的遺傳學(xué)及卵巢原發(fā)瘤灶、局部浸潤(rùn)、對(duì)側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移、腹腔大網(wǎng)膜和臟器表面種植、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水形成等卵巢癌的生物學(xué)特性[6-7],能夠更客觀、真實(shí)地反映人卵巢癌的臨床發(fā)展過(guò)程。手術(shù)切除標(biāo)本實(shí)體瘤模型病例結(jié)構(gòu)更接近人卵巢癌,但建模時(shí)間長(zhǎng)、難度大,成功率多為28%~40%[8-9],而細(xì)胞株建立模型的原代移植成功率則高達(dá)90%,腫瘤組織塊鼠間傳代的移植成功率高達(dá)100%[10]。所以,采用腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)后建模的方法較為理想。

        我們通過(guò)將人體腫瘤細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠BALB/c(nu/nu)體內(nèi)的移植方法,建立了人卵巢癌SKOV3 裸鼠原位移植瘤模型。該模型成瘤率高且穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)周期短,干預(yù)措施易于實(shí)施,且樣本的均一性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較為客觀,樣本脫落少,更能準(zhǔn)確真實(shí)地反映腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生演變過(guò)程。

        3.2 鴉膽子油乳聯(lián)合順鉑腹腔給藥治療卵巢癌的療效性分析

        中藥鴉膽子油乳注射液是由鴉膽子干燥的成熟果實(shí)提取的脂肪油經(jīng)乳化作用制成的水包油型乳劑,具有抗癌活性的油酸及亞油酸是其主要活性成分,并且可以與腫瘤細(xì)胞膜發(fā)生細(xì)胞特異性親和。鴉膽子油乳的有效成分具有細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤作用,能夠抑制腫瘤細(xì)胞的DNA 合成,使腫瘤細(xì)胞變性、破裂、壞死,同時(shí)作用于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng),改善細(xì)胞免疫狀態(tài)。這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。鴉膽子油乳主要通過(guò)質(zhì)膜系統(tǒng)和線粒體系統(tǒng)直接殺傷癌細(xì)胞,其活性成分不飽和脂肪酸可以通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞的-SH 基含量,使細(xì)胞膜變薄,從而增加對(duì)抗癌藥物的通透性,提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,有利于抗癌藥物的滲透。因此,在臨床上多采用鴉膽子油乳與常用抗癌藥聯(lián)合放化療治療腫瘤。

        1978 年美國(guó)首先批準(zhǔn)臨床采用順鉑治療腫瘤,其具有高效廣譜抗癌的特點(diǎn),抗腫瘤主要機(jī)制是可與腫瘤細(xì)胞DNA 結(jié)合,并破壞DNA 功能,阻斷其復(fù)制,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制[11]。此外,順鉑還參與腫瘤細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、水合解離、靶向遷移[12],均與其抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)。臨床上順鉑聯(lián)合化療仍是目前應(yīng)用廣泛的治療方案,其在提高患者生存率的同時(shí),也存在一定的毒性作用[13]。順鉑一般容易引起消化道反應(yīng)、骨髓抑制、腎毒性、耳毒性及周圍神經(jīng)毒性等副反應(yīng)。

        我們通過(guò)測(cè)量裸鼠移植瘤體積、抑瘤率等,發(fā)現(xiàn)鴉膽子油乳及其聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3 移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用;檢測(cè)裸鼠白細(xì)胞、血小板數(shù)目及肝腎功能的改變,顯示鴉膽子油乳相對(duì)于順鉑對(duì)人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞裸鼠白細(xì)胞及血小板、肝腎功能(ALT、LDH、CR)的影響較小,具有低毒作用,在一定程度上可以避免順鉑化療藥物所致的不良反應(yīng),在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。

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