梁智偉，王娟，田生禮，王立巖 ，劉剛

1.深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實驗室，深圳大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 深圳 518060；2.深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實驗室，深圳大學(xué) 海洋科學(xué)系，廣東 深圳 518060

小分子RNA廣泛存在于真核生物中，發(fā)揮諸如基因表達(dá)調(diào)控、降解mRNA等功能。近年來，在真菌中發(fā)現(xiàn)了多種小分子RNA，如粗糙脈孢霉（Neurospo?ra crassa）中 的 qiRNA 及 milRNA（microRNA like RNA）[1-2]、里氏木霉（Trichoderma reesei）中的milRNA[3]等。與高等真核生物中的情況類似，它們在真菌中發(fā)揮的作用也非常多樣，包括調(diào)控基因的表達(dá)、調(diào)控真菌的形態(tài)與致病性等[4-7]。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，在分子水平上對菌株進(jìn)行改良已逐步取代傳統(tǒng)的誘變選育技術(shù)[8]。里氏木霉是重要的纖維素酶生產(chǎn)菌，有關(guān)里氏木霉纖維素酶合成的調(diào)控機(jī)制在蛋白水平上的研究比較深入，而且在高產(chǎn)菌株選育中獲得了應(yīng)用。如通過對調(diào)控因子Cre1、xyR1等進(jìn)行干預(yù)，獲得了高產(chǎn)纖維素酶的基因工程菌株[9-10]。研究表明，里氏木霉中存在RNA干擾（RNAi）機(jī)制中的蛋白，如Ago家族蛋白等；此外，里氏木霉具有通過RNAi下調(diào)蛋白表達(dá)的能力[11]，說明在里氏木霉中存在非編碼RNA的表達(dá)、加工等作用機(jī)制。本課題組前期采用小RNA組測序和生物信息學(xué)方法，對里氏木霉中的miRNA進(jìn)行了分析和預(yù)測，鑒定出13個與miRNA結(jié)構(gòu)相似的小分子RNA（milRNA），其中1個在組成型培養(yǎng)條件下特異表達(dá)，6個在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中特異表達(dá)，6個在2種培養(yǎng)條件下同時表達(dá)。在誘導(dǎo)條件下，milR3、milR5和milR10的表達(dá)量上調(diào)顯著，分別為組成型培養(yǎng)條件下的 2.2、2.0 和 3.7 倍；milR7 和milR8的表達(dá)量下調(diào)顯著，為組成型培養(yǎng)條件下的0.2和0.4倍[3]。這些結(jié)果表明，里氏木霉中不僅存在與高等真核生物類似的RNAi機(jī)制，而且也具有形成小分子RNA的能力，且某些小分子RNA的表達(dá)與纖維素酶的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。

本研究中，我們挑選其中3個在纖維素酶表達(dá)受阻遏和誘導(dǎo)條件下均有表達(dá)且表達(dá)水平較高的小分子RNA，通過對它們過表達(dá)和抑制，進(jìn)行功能上的驗證，期望能找出參與調(diào)控纖維素酶表達(dá)調(diào)控功能的小分子RNA，為在分子水平上對里氏木霉進(jìn)行改造提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top10F'購自Invitrogen公司；里氏木霉QM9414購自美國模式菌種收藏中心（ATCC）；質(zhì)粒pUC-19購自TaKaRa公司；質(zhì)粒pAN7-1由本實驗室保藏（含潮霉素抗性基因hph，是進(jìn)行里氏木霉轉(zhuǎn)化的輔助質(zhì)粒）；重組質(zhì)粒p-Ppdc'-Tcbh1由本實驗室構(gòu)建［將5'-GGATCC-3'突變?yōu)?'-AGATCC-3'的Ppdc'啟動子（1534 bp）和Tcbh1（702 bp）終止子插入質(zhì)粒pUC-19而構(gòu)成（圖1A）］。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，用于平板培養(yǎng)時加入20 g/L瓊脂，用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化時加入100 μg/mL氨芐西林（In?vitrogen公司）。

PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g，去皮切碎后加至約1 L蒸餾水中，煮沸30 min，用4層紗布過濾，收集濾液，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂后定容至1 L，滅菌倒平板。進(jìn)行里氏木霉轉(zhuǎn)化子篩選時加入100 μg/mL潮霉素。

基本培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，尿素 0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.0016 g/L，ZnSO4·7H2O 0.0017 g/L，CoCl2·6H2O 0.0037 g/L，蛋白胨2 g/L，吐溫80 g/L，葡萄糖20 g/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：組分與基本培養(yǎng)基一致，用微晶纖維素（Sigma公司）20 g/L代替葡萄糖作為碳源。

1.2 菌株的培養(yǎng)

1.2.1 大腸桿菌的培養(yǎng) 含質(zhì)粒p-Ppdc'-Tchb1的大腸桿菌在50 mL含氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中于37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)入過表達(dá)盒和抑制表達(dá)盒后的大腸桿菌Top10F'，涂布于含氨芐西林的LB平板，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行篩選，將篩選到的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌在50 mL含氨芐西林的液體LB培養(yǎng)基中于37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。

1.2.2 里氏木霉的培養(yǎng) QM9414在PDA平板中培養(yǎng)7～10 d，用無菌水沖洗平板，收集孢子，取1×108孢子于30 mL基本培養(yǎng)基中，于28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；取2.5 mL菌液至50 mL基本培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，作為非誘導(dǎo)組（Con）；同樣取2.5 mL菌液至50 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，作為誘導(dǎo)組（Ind）。

1.2.3 里氏木霉纖維素酶的分泌誘導(dǎo) 孢子培養(yǎng)24 h后，取1.5 mL菌液至30 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，培養(yǎng)條件為28℃、250 r/min。

1.3 小分子RNA過表達(dá)盒和抑制表達(dá)盒的構(gòu)建

離心收集含重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）提取質(zhì)粒p-Ppdc'-Tchb1。

用真菌基因組DNA快速分離試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取QM9414基因組后，利用引物PCR-milR5、PCR-milR7、PCR-milR10（表1）分別擴(kuò)增pri-milR5、pri-milR7、pri-milR10，以及序列各自的前后約250 bp，并同時引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。將p-Ppdc'-Tcbh1載體和pri-milR5、primilR7及pri-milR10序列進(jìn)行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶（TaKaRa公司）分別連接載體與序列，獲得小分子RNA過表達(dá)表達(dá)盒p-Ppdc'-PremilRNA-Tcbh1（圖1B）。

表1 構(gòu)建小分子RNA過表達(dá)載體所用引物

表2 TuD序列

TuD序列（表2）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，主要由4個原件構(gòu)成：18 bp長的StemⅠ，2個與成熟miRNA互補(bǔ)配對的結(jié)合區(qū)MBS，與2個MBS連接的莖環(huán)結(jié)構(gòu)StemⅡ，以及4個連接StemⅠ、MBS和StemⅡ的Linker（圖1C）。序列兩端分別有SalⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，p-Ppdc'-Tcbh1和TuD序列經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，獲得小分子RNA抑制表達(dá)盒p-Ppdc'-TuD-Tcbh1。

1.4 里氏木霉的轉(zhuǎn)化

里氏木霉的轉(zhuǎn)化按照Wang等[10]的方法進(jìn)行。在轉(zhuǎn)化時，將10 μg過表達(dá)或10 μg抑制表達(dá)盒同時與10 μg pAN7-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化里氏木霉。轉(zhuǎn)化后將菌液涂布在含100 μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)3～4 d，待長出菌落后挑取單菌落，用微生物直接PCR裂解緩沖液（TaKaRa公司）裂解菌絲，利用TuD或milR-PCR驗證用引物進(jìn)行PCR，驗證過表達(dá)或抑制表達(dá)盒是否成功轉(zhuǎn)化里氏木霉。驗證引物見表3。

1.5 濾紙酶活測定

濾紙酶活（FPA）測定方法參考Ghost[12]，以What?man No.1濾紙為底物，測定D540nm值，每個樣品測定3次，結(jié)果取平均值。1個濾紙酶活力國際單位（FPU）的定義為在上述反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需酶量。

表3 轉(zhuǎn)化子驗證用引物

1.6 小分子RNA的提取以及加polyA尾和反轉(zhuǎn)錄

用mirVana PARIS Kit（Ambion公司）提取非誘導(dǎo)組（Con）和誘導(dǎo)組（Ind）各樣品的小分子RNA。用S-Poly（T）法處理 miRNA[13]，方法如下：首先用 Poly（A）聚合酶（Ambion公司）于37℃進(jìn)行polyA加尾，反應(yīng)時間30 min；然后用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶（TaKa?Ra公司）于42℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)時間30 min；最后于72℃滅活工具酶。得到產(chǎn)物用于qPCR。

1.7 RT-PCR檢測小分子RNA表達(dá)量

用TaqMan探針法檢測3個小分子RNA的變化，所用試劑盒為Premix Ex Taq（TaKaR公司）。以18S RNA為內(nèi)參，出發(fā)菌株QM9414為對照，通過ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量，比較小分子RNA的表達(dá)水平。所用引物及通用探針見表4。

2 結(jié)果

2.1 小分子RNA過表達(dá)和抑制表達(dá)盒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

為研究小分子RNA對QM9414產(chǎn)纖維素酶的影響，利用p-Ppdc'-Tcbh1載體分別構(gòu)建了小分子RNA的過表達(dá)盒（OE-milRNA）和抑制表達(dá)盒（TuD），并轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414，獲得過表達(dá)小分子RNA重組菌株OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10，以及抑制小分子RNA重組菌株TuD5、TuD7和TuD10。如圖2所示，轉(zhuǎn)入各OE-milRNA的重組菌株擴(kuò)增得到的特異條帶約600 bp，轉(zhuǎn)入各TuD的重組菌株擴(kuò)增得到的條帶略大于250 bp，與理論值相符，并分別與陽性對照大小基本一致，說明過表達(dá)和抑制表達(dá)盒已成功轉(zhuǎn)入QM9414。

表4 qPCR所用引物

圖1 小分子RNA過表達(dá)盒和TuD序列結(jié)構(gòu)

2.2 小分子RNA的過表達(dá)和抑制效果

表達(dá)盒轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414后，進(jìn)行熒光定量PCR分析，檢測OE-milRNA和TuD在轉(zhuǎn)化菌株中的作用，每個表達(dá)盒選取3個轉(zhuǎn)化子，結(jié)果取平均值。圖3A為出發(fā)菌株里氏木霉QM9414及轉(zhuǎn)入空載體p-Ppdc'-Tcbh1的重組菌株的RT-qPCR結(jié)果，說明p-Ppdc'-Tcbh1載體不會影響小分子RNA的表達(dá)；圖3B為OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10過表達(dá)小分子RNA的結(jié)果；圖3C為TuD5、TuD7和TuD10抑制小分子RNA的結(jié)果。結(jié)果表明，OE-mil?RNA和TuD的轉(zhuǎn)入分別可使小分子RNA的表達(dá)上調(diào)和抑制，且效果明顯。OE-milR5非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)組的小分子RNA表達(dá)量分別為出發(fā)菌株QM9414的7.91和 4.62倍，OE-milR7分別為 2.70和 3.87倍；而OE-milR10的效果最為明顯，與出發(fā)菌株相比，分別提高33.02和133.77倍。TuD5、TuD7和TuD10的表達(dá)量分別是出發(fā)菌株的0.51和0.57倍、0.83和 0.82倍、0.58和0.78倍，對小分子RNA的抑制效果明顯。

圖2 小分子RNA過表達(dá)和抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化里氏木霉后的PCR驗證結(jié)果A：過表達(dá)盒轉(zhuǎn)化后PCR驗證結(jié)果；B：抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化后PCR驗證結(jié)果；M：DNA marker；N：陰性對照（模板為里氏木霉QM9414的基因組DNA）；1：陽性對照（模板為質(zhì)粒p-Ppdc'-PremilR5-Tcbh1）；2～4：分別為OE-milR5、OE-milR7和OE-milR10的PCR擴(kuò)增結(jié)果；5：陽性對照（模板為質(zhì)粒p-Ppdc'-TuD10-Tcbh1）；6～8：分別為TuD5、TuD7和TuD10的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 小RNA對纖維素酶表達(dá)效率的影響

以微晶纖維素為誘導(dǎo)物培養(yǎng)重組菌株，測定濾紙酶活，以里氏木霉QM9414為對照，每個表達(dá)盒選取3個轉(zhuǎn)化子，測定結(jié)果取平均值。圖4A為重組菌株OE-milR5和重組菌株TuD5的誘導(dǎo)產(chǎn)酶情況與里氏木霉QM9414的比較，誘導(dǎo)144 h后，菌株OE-milR5的濾紙酶活較出發(fā)菌株略有下降，是QM9414的0.945倍，說明milR5可能對纖維素酶有下調(diào)作用。但抑制milR5對酶活無明顯影響，菌株TuD5是QM9414的1.013倍。

如圖4B所示，重組菌株OE-milR7的濾紙酶活是出發(fā)菌株的1.39倍，明顯高于出發(fā)菌株。重組菌株TuD7的濾紙酶活性改變不明顯，但有下降的趨勢，其酶活是出發(fā)菌株的0.977倍。說明milR7可能參與纖維素酶的調(diào)控。

如圖4C所示，OE-milR10和TuD10重組菌株的產(chǎn)酶能力均無明顯變化，其中菌株OE-milR10是出發(fā)菌株的1.015倍，菌株TuD10是出發(fā)菌株的1.014倍，表明milR10可能和纖維素酶調(diào)控?zé)o關(guān)。

為進(jìn)一步分析過表達(dá)和抑制小分子RNA對重組菌纖維素酶的影響，在不同的產(chǎn)酶培養(yǎng)時間取發(fā)酵液上清，測定濾紙酶活，結(jié)果如圖5A，轉(zhuǎn)入空載體的QM-NEG酶活與出發(fā)菌株基本一致，說明載體pPpdc'-Tcbh1不會對纖維素酶產(chǎn)生影響。

誘導(dǎo)初期（24 h），重組菌株和出發(fā)菌株的酶活基本一致。如圖5B、D所示，重組菌株與出發(fā)菌株相比，以及重組菌株與重組菌株間相比，酶活無明顯變化，說明milR5和milR10可能與纖維素酶調(diào)控?zé)o關(guān)。

根據(jù)圖5C，從48 h開始，OE-milR7酶活明顯比出發(fā)菌株高，至144 h時最高，是出發(fā)菌株的1.26倍，之后開始下降。TuD7在48～144 h期間，除96 h酶活略高于出發(fā)菌株外，均有下降趨勢，144 h時酶活是出發(fā)菌株的0.88倍。進(jìn)一步說明milR7可能屬于調(diào)控里氏木霉QM9414纖維素酶的小分子RNA。

圖3 重組菌株與出發(fā)菌株QM9414在非誘導(dǎo)（Con）和誘導(dǎo)（Ind）條件下小分子RNA表達(dá)情況的比較

圖4 小分子RNA過表達(dá)和抑制后濾紙酶活的比較結(jié)果A、B、C分別為重組菌株OE-milRNA和TuD5、TuD7和TuD10，均取誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)144 h后的發(fā)酵液上清測定濾紙酶活；顯著性檢驗采用雙尾檢驗，*P＜0.05

圖5 對小分子RNA過表達(dá)和抑制后濾紙酶活在不同時間的比較A：QM9414與QM-NEG比較；B：QM9414與OE-milR5和TuD5比較；C：QM9414與OE-milR7和TuD7比較；D：QM9414與OE-milR10和TuD10比較

3 討論

較多的研究表明，非編碼小分子RNA廣泛存在于絲狀真菌中，但其功能還需要進(jìn)行充分確認(rèn)和挖掘[14-16]。我們在前期研究基礎(chǔ)上，通過小分子RNA過表達(dá)和小分子RNA抑制技術(shù)，對里氏木霉QM9414中的3個小分子RNA在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中的功能進(jìn)行了分析。

對于小分子RNA的過表達(dá)方法，許多研究者選擇直接轉(zhuǎn)入人工合成的miRNA產(chǎn)品，如成熟miRNA模擬物（miRNA mimics），能短時間顯著提高小分子RNA的表達(dá)量；另外，構(gòu)建miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是常用方法之一，與前者相比，成本低，作用時間更長，并且能更好地模擬體內(nèi)小分子RNA的加工過程，效率更高。因此，采用構(gòu)建小分子RNA過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入里氏木霉QM9414中更具有應(yīng)用前景。

本工作參照miRNA前體即pre-miRNA加上其側(cè)翼序列的表達(dá)載體構(gòu)建形式[17-19]，根據(jù)Kang等[3]預(yù)測的約70 bp前體序列，加上其上下游各約250 bp，轉(zhuǎn)入使用里氏木霉強(qiáng)組成型啟動子Ppdc的p-Ppdc'-Tcbh1載體，提高了小分子RNA的表達(dá)量達(dá)2.70 至133.77 倍，與 mimics效果接近[20]。對小分子RNA成功地進(jìn)行過表達(dá)，說明里氏木霉QM9414和動植物一樣，存在產(chǎn)生小分子RNA的機(jī)制，進(jìn)一步證明小分子RNA存在于真菌中，并具有調(diào)控細(xì)胞生命活動的作用[21-22]。本研究使用的里氏木霉強(qiáng)啟動子Ppdc已應(yīng)用于高表達(dá)其內(nèi)源調(diào)控子基因[10,23-24]和構(gòu)建RNAi載體，介導(dǎo)調(diào)控子基因ace1的沉默[10]。

抑制小分子RNA的策略是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一段與其互補(bǔ)的RNA或DNA序列，該序列與小分子RNA結(jié)合，減少小分子RNA與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而抑制或下調(diào)小分子RNA的功能，如常見的miRNA海綿[25-26]、LidNA[27]和 Tough Decoy（TuD） RNA 序 列等。TuD序列是單鏈RNA分子，主要用于哺乳動物細(xì)胞的研究。另外，為提高序列的穩(wěn)定性和效果，在MBS區(qū)3'端第10和11個堿基處插入了“ATCT”。從結(jié)果可知TuD序列成功發(fā)揮作用，對小分子RNA的抑制率最高達(dá)49%，與應(yīng)用在哺乳動物細(xì)胞中效果相似[28-31]，表明里氏木霉與哺乳動物細(xì)胞的小分子RNA結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似，能夠和TuD序列結(jié)合。

對重組菌株測定濾紙酶活的結(jié)果表明，milR7可能參與纖維素酶的表達(dá)調(diào)控，其中TuD7酶活下降趨勢不明顯的原因可能是TuD序列對milR7抑制效果不佳所致，其表達(dá)量在纖維素酶非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)條件下，分別是出發(fā)菌株的0.83和0.82倍。根據(jù)研究，小分子RNA對其靶基因起負(fù)調(diào)控作用[32]，因此猜測milR7是通過調(diào)控纖維素酶活性的負(fù)調(diào)控因子，進(jìn)而提高纖維素酶的功能。

總之，我們通過構(gòu)建過表達(dá)和抑制表達(dá)盒，成功地對里氏木霉中的小分子RNA實現(xiàn)了過表達(dá)和抑制。對重組菌株的纖維素酶產(chǎn)酶能力進(jìn)行分析，結(jié)合小分子RNA的過表達(dá)和抑制情況，獲得了一個與里氏木霉纖維素酶表達(dá)調(diào)控有明確關(guān)系的小分子RNA——milR7。本工作為改善里氏木霉的產(chǎn)纖維素酶能力提供了新的途徑。將小分子RNA調(diào)控和蛋白調(diào)控因子結(jié)合起來，將有可能通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步提高里氏木霉的產(chǎn)纖維素酶能力。

[1] 陳潤生.關(guān)于非編碼RNA研究的一些思考[J].生命科學(xué),2010,22(7):594-597.

[2] 李立平,羅玉萍,李思光.真菌非編碼RNA[J].微生物學(xué)報,2013,53(8):790-797.

[3] Kang K,Zhong J,Jiang L,et al.Identification of microRNALike RNAs in the filamentous fungus Trichoderma reesei by solexa sequencing[J].PLoS One,2013,8(10):e76288.

[4] Huisinga K L,Elgin S C.Small RNA-directed heterochroma?tin formation in the context of development:what flies might learn from fission yeast[J].Biochim Biophys Acta,2009,1789(1):3-16.

[5] Chinen M,Morita M,Fukumura K,et al.Involvement of the spliceosomal U4 small nuclear RNA in heterochromatic gene silencing at fission yeast centromeres[J].J Biol Chem,2010,285(8):5630-5638.

[6] Simmer F,Buscaino A,Kos-Braun I C,et al.Hairpin RNA induces secondary small interfering RNA synthesis and silenc?ing in trans in fission yeast[J].EMBO Rep,2010,11(2):112-118.

[7] Harrison B R,Yazgan O,Krebs J E.Life without RNAi:non?coding RNAs and their functions in Saccharomyces cerevisiae[J].Biochem Cell Biol,2009,87(5):767-779.

[8] Peterson R,Nevalainen H.Trichoderma reesei RUT-C30--thir?ty years of strain improvement[J].Microbiology,2012,158(1):58-68.

[9] Wang S,Liu G,Yu J,et al.RNA interference with carbon catabolite repression in Trichoderma koningiiforenhancing cellulase production[J].Enzyme Microbial Technol,2013,53(2):104-109.

[10]Wang S,Liu G,Wang J,et al.Enhancing cellulase produc?tion in Trichoderma reesei RUT C30 through combined manip?ulation of activating and repressing genes[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2013,40(6):633-641.

[11]Brody H,Maiyuran S.RNAi-mediated gene silencing of high?ly expressed genes in the industrial fungi Trichoderma reesei and Aspergillus niger[J].Ind Biotechnol,2009,5(1):53-60.

[12]Ghose T.Measurement of cellulase activities[J].Pure Appl Chem,1987,59(2):257-268.

[13]Kang K,Zhang X,Liu H,et al.A novel real-time PCR as?say of microRNAs using S-Poly(T),a specific oligo(dT)re?verse transcription primer with excellent sensitivity and speci?ficity[J].PLoS One,2012,7(11):e48536.

[14]Lee H C,Li L,Gu W,et al.Diverse pathways generate mi?croRNA-like RNAs and Dicer-independent small interfering RNAs in fungi[J].Mol Cell,2010,38(6):803-814.

[15]Zhou J,Fu Y,Xie J,et al.Identification of microRNA-like RNAs in a plant pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum by high-throughput sequencing[J].Mol Genet Genomics,2012,287(4):275-282.

[16]Chen R,Jiang N,Jiang Q,et al.Exploring microRNA-like small RNAs in the filamentous fungus Fusarium oxysporum[J].PLoS One,2014,9(8):e104956.

[17]Zeng Y,Wagner E J,Cullen B R.Both natural and designed microRNAscan inhibitthe expression ofcognate mRNAs when expressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6):1327-1333.

[18]Grishok A,Pasquinelli A E,Conte D,et al.Genes and mech?anisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C.elegans developmental tim?ing[J].Cell,2001,106(1):23-34.

[19]Park J E,Heo I,Tian Y,et al.Dicer recognizes the 5'end of RNA for efficient and accurate processing[J].Nature,2011,475(7355):201-205.

[20]Bader A G,Brown D,Winkler M.The promise of microRNA replacement therapy[J].Cancer Res,2010,70(18):7027-7030.

[21]王紹文,劉剛,邢苗,等.絲狀真菌中的RNA干擾及其應(yīng)用技術(shù)[J].生物技術(shù)通報,2011,(10):77-83.

[22]弭寶彬,李娟娟,陳國華.絲狀真菌小RNA研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2013,25(009):915-921.

[23]Li J,Wang J,Wang S,et al.Achieving efficient protein ex?pression in Trichodermareeseibyusingstrongconstitutive promoters[J].Microbial Cell Factories,2012,11(1):84.

[24]Wang J,Zeng D,Mai G,et al.Homologous constitutive ex?pression of Xyn III in Trichoderma reesei QM9414 and its characterization[J].Folia Microbiol,2014,59(3):229-233.

[25]Ebert M S,Neilson J R,Sharp P A.microRNA sponges:com?petitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells[J].Nat Methods,2007,4(9):721-726.

[26]Ebert M S,Sharp P A.microRNA sponges:progress and pos?sibilities[J].RNA,2010,16(11):2043-2050.

[27]Tachibana A,Yamada Y,Ida H,et al.LidNA,a novel mi?croRNA inhibitor constructed with unmodified DNA[J].FEBS Lett,2012,586(10):1529-1532.

[28]Haraguchi T,Ozaki Y,Iba H.Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific mi?croRNA activity in mammalian cells[J].Nucleic Acids Res,2009,37(6):e43.

[29]Sakurai F,Furukawa N,Higuchi M,et al.Suppression of hep?atitis C virus replicon by adenovirus vector-mediated expres?sion of tough decoy RNA against miR-122a[J].Virus Res,2012,165(2):214-218.

[30]Bak R O,Hollensen A K,Primo M N,et al.Potent miRNA suppression by RNA Pol II-transcribed'Tough Decoy'inhibi?tors[J].RNA,2013,19(2):280-293.

[31]Haraguchi T,Nakano H,Tagawa T,et al.A potent 2'-O-methylated RNA-based microRNA inhibitor with unique sec?ondary structures[J].Nucleic Acids Res,2012,40(8):e58.

[32]Carthew R W,Sontheimer E J.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4):642-655.