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        人白細胞介素7在CHO細胞中的表達及活性鑒定

        2015-05-04 08:03:50李金松麻粉蓮張騫鄭麗舒
        生物技術通訊 2015年4期
        關鍵詞:潮霉素孔板單克隆

        李金松,麻粉蓮,張騫,鄭麗舒

        中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所,北京 100052

        白細胞介素(interleukins,IL)是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子,具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。白細胞介素7(IL-7)是由腸道上皮細胞,淋巴結的濾泡樹突狀細胞和網(wǎng)狀纖維細胞,脾、骨髓和胸腺等基質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子[1-2]。IL-7通過CD127和CD132受體復合物激活Janus激酶(JAK)1/JAK3信號,激活信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化蛋白5(STAT5)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)提高抗凋亡蛋白表達等,來提高T細胞分化發(fā)育、成熟的T細胞的存活和胸腺輸出新生的T細胞,因此對T細胞的細胞穩(wěn)態(tài)起關鍵作用[3-5]。不僅能夠促進免疫系統(tǒng)恢復,還可以消除慢病毒或腫瘤引起的免疫耐受。αβ-T細胞對一些蛋白、病毒慢性感染或腫瘤等免疫反應較弱,但IL-7能增強這種免疫反應。盡管高效的抗病毒治療已顯著降低了HIV感染的發(fā)病率和死亡率,并且病毒被持續(xù)抑制,但大部分接受抗病毒治療的患者CD4+T細胞恢復較差。近期的研究證明,IL-7能夠通過提高幼稚T細胞和組織中的T細胞恢復,顯著提高HIV感染者的T細胞系統(tǒng)重建[6-7]。

        位點特異重組可以克服隨機整合效率低等問題,其中酵母的FLP/FRT系統(tǒng)是常見的位點特異性重組工具,并被廣泛應用。Invitrogen公司的Flp-In重組系統(tǒng)通過pOG44質(zhì)粒產(chǎn)生重組酶,將表達外源蛋白的pcDNA5/FRT整合于Flp-In-CHO細胞,該細胞在基因組活性區(qū)整合了相應的FRT位點。在此,我們利用Flp-In-CHO細胞表達人IL-7,并對其相關功能做了初步研究,為其藥物開發(fā)和應用提供基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        Flp-In-CHO細胞、CellTrace CFSE Cell Prolif?eration Kit、pOG44質(zhì)粒、pcDNA5/FRT質(zhì)粒、F12培養(yǎng)基、牛血清、LipofectAMINE2000、潮霉素B購自Life Technology公司;Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品;Gel Extraction Kit、Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit購自 Qiagen公司;Prestained Protein Marker購自博邁德生物有限公司;Human IL-7 ELISA Kit購自Abcam公司;人IL-7單克隆抗體購自R&D公司;流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品;FITC標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司。

        IL-7基因(GenBank:KJ891458.1)全長531 bp,編碼由177個氨基酸殘基構成的蛋白,使用linker加上CTP蛋白。按照CHO細胞密碼子偏嗜性進行優(yōu)化,5'和3'端分別添加NheⅠ和NotⅠ酶切位點,由Life Technology公司合成。

        1.2 表達載體構建

        按試劑盒說明書提取質(zhì)粒,用NheⅠ和NotⅠ分別酶切pGEM-T easy載體上的IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒,反應體系50 μL,37℃水浴4 h,1.3%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,30 min)檢測。將IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒進行膠回收,所得產(chǎn)物用于連接,反應體系10 μL,4℃水浴過夜。將獲得的pcDNA5/FRT-IL-7表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測序確認,用 Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit大提質(zhì)粒。

        1.3 基因轉(zhuǎn)染和陽性細胞克隆的篩選

        接種細胞至24孔細胞培養(yǎng)板,次日細胞約布滿85%,加入潮霉素B(終濃度依次為300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL)進行篩選,培養(yǎng)10~14 d,以最低細胞全部死亡濃度為基準測算潮霉素B殺傷Flp-In-CHO細胞的最小濃度。

        將1×106Flp-In-CHO細胞鋪于6孔板上,待細胞鋪滿整孔90%時轉(zhuǎn)染。pcDNA5/FRT-IL-7-CTP和輔助質(zhì)粒pOG44按1∶9的摩爾比混合,將4 μg質(zhì)粒和 5 μL Lipo2000 分別稀釋于 250 μL optim-MEM培養(yǎng)基中,混合后,加入一孔用optim-MEM培養(yǎng)基洗滌過的CHO細胞中,共同孵育5 h后換成含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基,24 h后轉(zhuǎn)入小瓶,用700 μg/mL潮霉素B加壓篩選,2~3周后獲得陽性克隆,將該陽性克隆細胞稀釋至約100/20 mL培養(yǎng)基后接種于96孔板,而后逐漸將單個細胞形成的克隆轉(zhuǎn)至24孔板和6孔板放大培養(yǎng),收集上清。

        1.4 間接免疫熒光法檢測細胞表達的目的蛋白

        將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞或單克隆細胞轉(zhuǎn)移至一個新的24孔板,次日于4℃培養(yǎng)30 min后棄去培養(yǎng)液,用PBS洗細胞3次,每孔加入800 μL預冷的甲醇,-20℃固定細胞20 min,棄去甲醛液,用PBS洗細胞3次,每孔加入1∶1000稀釋的小鼠抗人IL-7單克隆抗體,37℃孵育1 h,棄去一抗,用PBS洗細胞4次,再加入1∶5000稀釋的FITC標記的羊抗小鼠IgG,37℃孵育1 h,最后用PBS洗細胞4次,熒光顯微鏡下觀察結果。

        1.5 細胞染色體上整合的目的基因檢測和細胞穩(wěn)定性鑒定

        按照核酸提取試劑盒說明書提取單克隆細胞核酸,使用特異性引物擴增。反應體積為25 μL,包括50 pmol/μL 引物各 1 μL、5×反應緩沖液 5 μL、dNTP 1 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應條件:94℃變性 5 min;94℃ 30 s,52℃30 s,72℃ 35 s,30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行觀察。將單克隆細胞傳至5代和8代后提取核酸,用上述PCR方法檢測,驗證該插入片段是否依然存在。

        1.6 Western印跡檢測IL-7的表達

        將篩選獲得的單克隆細胞株擴大培養(yǎng),收集5×106細胞煮沸,收集1.5 L細胞培養(yǎng)液上清,平均分成4份,分別進行40%、50%、70%和80%硫酸銨飽和度沉淀,10 000 r/min離心30 min,收集4份沉淀,均將其用20 nmol/L PB和0.5 mol/L NaCl稀釋,并在該液體中透析后超濾濃縮,煮沸后進行12%的SDSPAGE。采用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,再將膜置于5%脫脂奶粉中,于4℃振蕩過夜;次日,依次加入小鼠抗IL-7單抗和HRP標記的羊抗小鼠IgG,洗膜后,應用TBM顯色。

        1.7 IL-7表達水平檢測

        取單克隆細胞24 h培養(yǎng)液稀釋至1/1000備用。將試劑盒中的標準品按1/3的梯度稀釋,用IL-7 ELISA試劑盒進行檢測,加入終止液后,在酶標儀上讀取D450nm值。

        1.8 IL-7促外周血單核細胞增殖活性

        抽取20 mL人靜脈血,用達科為公司外周血淋巴分離液試劑盒分離外周血單核細胞,用含10%FBS、10 mg/mL PHA-P的 1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 5 d,PBS洗滌細胞,0.1%FBS/PBS重懸細胞,并將細胞分為7管,每管1×106細胞(約250 μL);用DMSO將5 mmol/L的CFSE稀釋至5 μmol/L后每管加入500 μL,37℃孵育10 min,用冰冷的FBS立即終止標記10 min;離心洗滌2次,用含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細胞,向b~f管分別加入IL-7;用正常Flp-In-CHO細胞培養(yǎng)24 h的上清稀釋R&D公司的IL-7作為對照,IL-7濃度分別為1、5和10 ng/mL,標記為b、c、d管。上述ELISA定量的單克隆細胞上清,IL-7的終濃度也為1、5和10 ng/mL,標記為e、f、g管。a管為PHA-P刺激,不加IL-7的陰性對照。IL-7刺激72 h后上機檢測。

        2 結果

        2.1 重組表達質(zhì)粒鑒定

        PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析表明片段大小符合預期。以BGH和CMV為引物測定表達載體上的目的片段,未見突變位點。PCR電泳圖與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞PCR鑒定電泳圖相似。見圖1。

        2.2 潮霉素B篩選陽性細胞及單克隆化

        用700 μg/mL潮霉素B篩選,約14 d后,經(jīng)96孔板單克隆化,鑒定獲得2株IL-7表達量較高的單克隆細胞株,分別命名為CHO-IL-7-C3和CHO-IL-7-D7。

        2.3 單克隆細胞中整合的目的基因檢測和穩(wěn)定性檢測

        收集單克隆細胞,反復凍融3次后,用QIAGEN公司核酸提取試劑盒提取核酸,以CMV和BGH為引物進行PCR擴增(圖1)。細胞傳5~8代后,仍能在該細胞上檢測到目的基因(此部分電泳圖略)。

        2.4 Western印跡檢測上清和細胞內(nèi)的目的蛋白

        由于表達的是分泌蛋白,所以細胞內(nèi)IL-7含量較低,但通過Western印跡可以檢測到目的蛋白。細胞培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸銨沉淀濃縮后,可見目的蛋白主要集中在用40%~80%飽和硫酸銨沉淀中。見圖2。

        2.5 IL-7表達水平測定

        通過ELISA標準曲線測定,按照該試劑盒說明書計算,所篩選到的2株細胞的IL-7表達量為3~4 mg/L(具體數(shù)據(jù)略)。

        2.6 IL-7-CTP蛋白促外周血單核細胞增殖活性

        用CSFE標記的外周血單核細胞經(jīng)不同濃度的CHO表達的IL-7和R&D公司的IL-7處理后,P3代細胞增殖情況見圖3,可見用CHO表達的IL-7的促外周血增殖能力明顯強于R&D公司的對照產(chǎn)品。

        3 討論

        病毒必須在細胞內(nèi)才能繁殖,在抗病毒的同時加上免疫治療具有很好的應用前景,近年來在HIV多靶點治療方面取得了突破性進展,其中最重要的經(jīng)驗是抗病毒治療與免疫治療的多靶向聯(lián)合治療,如IL-7和HIV疫苗抗病毒藥物聯(lián)合使用等[8]。IL-7是一種多能性的免疫調(diào)節(jié)劑,目前國際上正在進行的相關臨床試驗就有20項,主要針對癌癥,如乳腺癌、結腸癌、膀胱癌等[9-10]。所以,開展IL-7的表達、生物活性和功能的相關研究是非常必要的。

        定點表達系統(tǒng)避開了隨機整合在非熱點區(qū)而導致表達量較低的缺陷,易于篩選,但要篩選到很高表達量的細胞株也非常困難。本實驗中,我們通過ELISA、PCR、Western印跡等方法,在細胞轉(zhuǎn)染、篩選、穩(wěn)定傳代等多階段均證明了IL-7的表達,并進行了定量。由于表達的IL-7是分泌蛋白,所以細胞內(nèi)的蛋白量較低,Western印跡檢測顯示條帶較弱。而經(jīng)過硫酸銨沉淀后,蛋白量得以富集,并且主要存在于40%~80%飽和硫酸銨溶液沉淀中,對下一步純化實驗較為有利。但還須進一步篩選表達量更高的細胞株,為后續(xù)研究甚至生產(chǎn)奠定好的基礎。

        圖1 重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-IL-7的PCR(A)和酶切(B)鑒定

        圖2 IL-7-CTP經(jīng)40%~90%硫酸銨沉淀(A)和單克隆細胞(B)的Western印跡M:蛋白marker;1:單克隆細胞CHO-IL-7-C3;2:單克隆細胞CHO-IL-7-D7;3:未轉(zhuǎn)染的CHO細胞

        促外周血單核細胞增殖試驗結果表明,本研究獲得的IL-7在各濃度梯度均可促進外周血單核細胞增殖,且作用優(yōu)于R&D公司的IL-7??赡苁且驗槲覀儾捎肅HO細胞表達體系,而對照品為原核系統(tǒng)表達。IL-7含有4個N糖基化和1個O糖基化位點,3個二硫鍵,原核系統(tǒng)表達時不能形成正確的糖基鏈,而在CHO細胞中經(jīng)過修飾后,可以形成正確的糖基化及空間結構[11],因此其功能要強于R&D公司的產(chǎn)品。

        圖3 CHO培養(yǎng)上清和R&D公司的IL-7促外周血單核細胞增殖活性a:僅用PHA刺激;b、c、d:分別為1、5和10 ng/mL R&D公司的IL-7刺激;e、f、g:分別為1、5和10 ng/mL CHO培養(yǎng)上清的IL-7刺激

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