李金松，麻粉蓮，張騫，鄭麗舒

中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 100052

白細胞介素（interleukins，IL）是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。白細胞介素7（IL-7）是由腸道上皮細胞，淋巴結的濾泡樹突狀細胞和網(wǎng)狀纖維細胞，脾、骨髓和胸腺等基質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種多功能細胞因子[1-2]。IL-7通過CD127和CD132受體復合物激活Janus激酶（JAK）1/JAK3信號，激活信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化蛋白5（STAT5）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）提高抗凋亡蛋白表達等，來提高T細胞分化發(fā)育、成熟的T細胞的存活和胸腺輸出新生的T細胞，因此對T細胞的細胞穩(wěn)態(tài)起關鍵作用[3-5]。不僅能夠促進免疫系統(tǒng)恢復，還可以消除慢病毒或腫瘤引起的免疫耐受。αβ-T細胞對一些蛋白、病毒慢性感染或腫瘤等免疫反應較弱，但IL-7能增強這種免疫反應。盡管高效的抗病毒治療已顯著降低了HIV感染的發(fā)病率和死亡率，并且病毒被持續(xù)抑制，但大部分接受抗病毒治療的患者CD4+T細胞恢復較差。近期的研究證明，IL-7能夠通過提高幼稚T細胞和組織中的T細胞恢復，顯著提高HIV感染者的T細胞系統(tǒng)重建[6-7]。

位點特異重組可以克服隨機整合效率低等問題，其中酵母的FLP/FRT系統(tǒng)是常見的位點特異性重組工具，并被廣泛應用。Invitrogen公司的Flp-In重組系統(tǒng)通過pOG44質(zhì)粒產(chǎn)生重組酶，將表達外源蛋白的pcDNA5/FRT整合于Flp-In-CHO細胞，該細胞在基因組活性區(qū)整合了相應的FRT位點。在此，我們利用Flp-In-CHO細胞表達人IL-7，并對其相關功能做了初步研究，為其藥物開發(fā)和應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Flp-In-CHO細胞、CellTrace CFSE Cell Prolif?eration Kit、pOG44質(zhì)粒、pcDNA5/FRT質(zhì)粒、F12培養(yǎng)基、牛血清、LipofectAMINE2000、潮霉素B購自Life Technology公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit、Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit購自 Qiagen公司；Prestained Protein Marker購自博邁德生物有限公司；Human IL-7 ELISA Kit購自Abcam公司；人IL-7單克隆抗體購自R&D公司；流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品；FITC標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司。

IL-7基因（GenBank：KJ891458.1）全長531 bp，編碼由177個氨基酸殘基構成的蛋白，使用linker加上CTP蛋白。按照CHO細胞密碼子偏嗜性進行優(yōu)化，5'和3'端分別添加NheⅠ和NotⅠ酶切位點，由Life Technology公司合成。

1.2 表達載體構建

按試劑盒說明書提取質(zhì)粒，用NheⅠ和NotⅠ分別酶切pGEM-T easy載體上的IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒，反應體系50 μL，37℃水浴4 h，1.3%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，30 min）檢測。將IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒進行膠回收，所得產(chǎn)物用于連接，反應體系10 μL，4℃水浴過夜。將獲得的pcDNA5/FRT-IL-7表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測序確認，用 Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit大提質(zhì)粒。

1.3 基因轉(zhuǎn)染和陽性細胞克隆的篩選

接種細胞至24孔細胞培養(yǎng)板，次日細胞約布滿85%，加入潮霉素B（終濃度依次為300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL）進行篩選，培養(yǎng)10～14 d，以最低細胞全部死亡濃度為基準測算潮霉素B殺傷Flp-In-CHO細胞的最小濃度。

將1×106Flp-In-CHO細胞鋪于6孔板上，待細胞鋪滿整孔90%時轉(zhuǎn)染。pcDNA5/FRT-IL-7-CTP和輔助質(zhì)粒pOG44按1∶9的摩爾比混合，將4 μg質(zhì)粒和 5 μL Lipo2000 分別稀釋于 250 μL optim-MEM培養(yǎng)基中，混合后，加入一孔用optim-MEM培養(yǎng)基洗滌過的CHO細胞中，共同孵育5 h后換成含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，24 h后轉(zhuǎn)入小瓶，用700 μg/mL潮霉素B加壓篩選，2～3周后獲得陽性克隆，將該陽性克隆細胞稀釋至約100/20 mL培養(yǎng)基后接種于96孔板，而后逐漸將單個細胞形成的克隆轉(zhuǎn)至24孔板和6孔板放大培養(yǎng)，收集上清。

1.4 間接免疫熒光法檢測細胞表達的目的蛋白

將轉(zhuǎn)染24 h后的細胞或單克隆細胞轉(zhuǎn)移至一個新的24孔板，次日于4℃培養(yǎng)30 min后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗細胞3次，每孔加入800 μL預冷的甲醇，-20℃固定細胞20 min，棄去甲醛液，用PBS洗細胞3次，每孔加入1∶1000稀釋的小鼠抗人IL-7單克隆抗體，37℃孵育1 h，棄去一抗，用PBS洗細胞4次，再加入1∶5000稀釋的FITC標記的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，最后用PBS洗細胞4次，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 細胞染色體上整合的目的基因檢測和細胞穩(wěn)定性鑒定

按照核酸提取試劑盒說明書提取單克隆細胞核酸，使用特異性引物擴增。反應體積為25 μL，包括50 pmol/μL 引物各 1 μL、5×反應緩沖液 5 μL、dNTP 1 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應條件：94℃變性 5 min；94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 35 s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行觀察。將單克隆細胞傳至5代和8代后提取核酸，用上述PCR方法檢測，驗證該插入片段是否依然存在。

1.6 Western印跡檢測IL-7的表達

將篩選獲得的單克隆細胞株擴大培養(yǎng)，收集5×106細胞煮沸，收集1.5 L細胞培養(yǎng)液上清，平均分成4份，分別進行40%、50%、70%和80%硫酸銨飽和度沉淀，10 000 r/min離心30 min，收集4份沉淀，均將其用20 nmol/L PB和0.5 mol/L NaCl稀釋，并在該液體中透析后超濾濃縮，煮沸后進行12%的SDSPAGE。采用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再將膜置于5%脫脂奶粉中，于4℃振蕩過夜；次日，依次加入小鼠抗IL-7單抗和HRP標記的羊抗小鼠IgG，洗膜后，應用TBM顯色。

1.7 IL-7表達水平檢測

取單克隆細胞24 h培養(yǎng)液稀釋至1/1000備用。將試劑盒中的標準品按1/3的梯度稀釋，用IL-7 ELISA試劑盒進行檢測，加入終止液后，在酶標儀上讀取D450nm值。

1.8 IL-7促外周血單核細胞增殖活性

抽取20 mL人靜脈血，用達科為公司外周血淋巴分離液試劑盒分離外周血單核細胞，用含10%FBS、10 mg/mL PHA-P的 1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 5 d，PBS洗滌細胞，0.1%FBS/PBS重懸細胞，并將細胞分為7管，每管1×106細胞（約250 μL）；用DMSO將5 mmol/L的CFSE稀釋至5 μmol/L后每管加入500 μL，37℃孵育10 min，用冰冷的FBS立即終止標記10 min；離心洗滌2次，用含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細胞，向b～f管分別加入IL-7；用正常Flp-In-CHO細胞培養(yǎng)24 h的上清稀釋R&D公司的IL-7作為對照，IL-7濃度分別為1、5和10 ng/mL，標記為b、c、d管。上述ELISA定量的單克隆細胞上清，IL-7的終濃度也為1、5和10 ng/mL，標記為e、f、g管。a管為PHA-P刺激，不加IL-7的陰性對照。IL-7刺激72 h后上機檢測。

2 結果

2.1 重組表達質(zhì)粒鑒定

PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析表明片段大小符合預期。以BGH和CMV為引物測定表達載體上的目的片段，未見突變位點。PCR電泳圖與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞PCR鑒定電泳圖相似。見圖1。

2.2 潮霉素B篩選陽性細胞及單克隆化

用700 μg/mL潮霉素B篩選，約14 d后，經(jīng)96孔板單克隆化，鑒定獲得2株IL-7表達量較高的單克隆細胞株，分別命名為CHO-IL-7-C3和CHO-IL-7-D7。

2.3 單克隆細胞中整合的目的基因檢測和穩(wěn)定性檢測

收集單克隆細胞，反復凍融3次后，用QIAGEN公司核酸提取試劑盒提取核酸，以CMV和BGH為引物進行PCR擴增（圖1）。細胞傳5～8代后，仍能在該細胞上檢測到目的基因（此部分電泳圖略）。

2.4 Western印跡檢測上清和細胞內(nèi)的目的蛋白

由于表達的是分泌蛋白，所以細胞內(nèi)IL-7含量較低，但通過Western印跡可以檢測到目的蛋白。細胞培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸銨沉淀濃縮后，可見目的蛋白主要集中在用40%～80%飽和硫酸銨沉淀中。見圖2。

2.5 IL-7表達水平測定

通過ELISA標準曲線測定，按照該試劑盒說明書計算，所篩選到的2株細胞的IL-7表達量為3～4 mg/L（具體數(shù)據(jù)略）。

2.6 IL-7-CTP蛋白促外周血單核細胞增殖活性

用CSFE標記的外周血單核細胞經(jīng)不同濃度的CHO表達的IL-7和R&D公司的IL-7處理后，P3代細胞增殖情況見圖3，可見用CHO表達的IL-7的促外周血增殖能力明顯強于R&D公司的對照產(chǎn)品。

3 討論

病毒必須在細胞內(nèi)才能繁殖，在抗病毒的同時加上免疫治療具有很好的應用前景，近年來在HIV多靶點治療方面取得了突破性進展，其中最重要的經(jīng)驗是抗病毒治療與免疫治療的多靶向聯(lián)合治療，如IL-7和HIV疫苗抗病毒藥物聯(lián)合使用等[8]。IL-7是一種多能性的免疫調(diào)節(jié)劑，目前國際上正在進行的相關臨床試驗就有20項，主要針對癌癥，如乳腺癌、結腸癌、膀胱癌等[9-10]。所以，開展IL-7的表達、生物活性和功能的相關研究是非常必要的。

定點表達系統(tǒng)避開了隨機整合在非熱點區(qū)而導致表達量較低的缺陷，易于篩選，但要篩選到很高表達量的細胞株也非常困難。本實驗中，我們通過ELISA、PCR、Western印跡等方法，在細胞轉(zhuǎn)染、篩選、穩(wěn)定傳代等多階段均證明了IL-7的表達，并進行了定量。由于表達的IL-7是分泌蛋白，所以細胞內(nèi)的蛋白量較低，Western印跡檢測顯示條帶較弱。而經(jīng)過硫酸銨沉淀后，蛋白量得以富集，并且主要存在于40%～80%飽和硫酸銨溶液沉淀中，對下一步純化實驗較為有利。但還須進一步篩選表達量更高的細胞株，為后續(xù)研究甚至生產(chǎn)奠定好的基礎。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-IL-7的PCR（A）和酶切（B）鑒定

圖2 IL-7-CTP經(jīng)40%～90%硫酸銨沉淀（A）和單克隆細胞（B）的Western印跡M：蛋白marker；1：單克隆細胞CHO-IL-7-C3；2：單克隆細胞CHO-IL-7-D7；3：未轉(zhuǎn)染的CHO細胞

促外周血單核細胞增殖試驗結果表明，本研究獲得的IL-7在各濃度梯度均可促進外周血單核細胞增殖，且作用優(yōu)于R&D公司的IL-7?？赡苁且驗槲覀儾捎肅HO細胞表達體系，而對照品為原核系統(tǒng)表達。IL-7含有4個N糖基化和1個O糖基化位點，3個二硫鍵，原核系統(tǒng)表達時不能形成正確的糖基鏈，而在CHO細胞中經(jīng)過修飾后，可以形成正確的糖基化及空間結構[11]，因此其功能要強于R&D公司的產(chǎn)品。

圖3 CHO培養(yǎng)上清和R&D公司的IL-7促外周血單核細胞增殖活性a：僅用PHA刺激；b、c、d：分別為1、5和10 ng/mL R&D公司的IL-7刺激；e、f、g：分別為1、5和10 ng/mL CHO培養(yǎng)上清的IL-7刺激

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