尹可欣，遲象陽(yáng)，任軍，房婷，劉樹(shù)玲，劉炬，楊秀旭，李建民，于長(zhǎng)明

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室，北京 100071

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的人畜共患烈性傳染病，人和嚙齒類動(dòng)物容易感染，人類通過(guò)接觸感染的動(dòng)物、食入污染食物或鼠蚤類動(dòng)物叮咬等途徑被感染。依據(jù)發(fā)病部位和病理變化的不同，鼠疫主要分為3種臨床類型，即腺鼠疫、敗血癥鼠疫和肺鼠疫，其中肺鼠疫是毒性最強(qiáng)和致死率最高的類型[1]。F1抗原是鼠疫耶爾森菌重要的毒力因子，由pFra質(zhì)粒上的Caf1基因編碼，表達(dá)后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌表面形成莢膜樣結(jié)構(gòu)參與鼠疫菌的抗吞噬作用[2]。同時(shí)，F(xiàn)1抗原是目前已明確的鼠疫保護(hù)性抗原，誘導(dǎo)的免疫以體液免疫為主，在鼠疫耶爾森菌的感染與免疫中發(fā)揮重要作用[3-5]，英、美目前進(jìn)行臨床研究的鼠疫疫苗 均 含 有 F1 抗 原（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT01381744，NCT00332956）。

表位是抗原分子中具有特殊結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，決定抗原特異性，是T、B淋巴細(xì)胞表面特異性抗原受體（TCR/BCR）和抗體特異性結(jié)合的基本結(jié)構(gòu)單位，在抗原中起著關(guān)鍵性作用。根據(jù)引起體液免疫或細(xì)胞免疫的不同，表位通常被分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，介導(dǎo)細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)，是抗原引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部分。表位疫苗正是基于這一理論基礎(chǔ)提出來(lái)的。鞭毛蛋白是革蘭陰性菌鞭毛纖維的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由N、C端保守區(qū)和中間高變區(qū)組成，在不同的菌株和物種之間高變區(qū)的大小和氨基酸組成具有很大的差異[6]，F(xiàn)liC對(duì)應(yīng)的是沙門菌鞭毛蛋白基因編碼的主要產(chǎn)物。鞭毛蛋白的保守區(qū)結(jié)合Toll樣受體5（TLR5）的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，活化NF-κF信號(hào)通路[7]，促進(jìn)炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、協(xié)同刺激分子等的產(chǎn)生，將先天性免疫和適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來(lái)發(fā)揮佐劑功能[8]，完整的鞭毛蛋白或其片段均可作為佐劑，也可作為黏膜佐劑，還有報(bào)道其在老齡免疫系統(tǒng)中仍具有佐劑活性[9]。此外，基于鞭毛蛋白佐劑的疫苗僅需較低劑量即可激起有效的免疫反應(yīng)[10]，目前以鞭毛蛋白為佐劑的重組流感疫苗和重組鼠疫疫苗均在進(jìn)行臨床研究。

在本研究中，我們應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)，篩選與F1抗原的中和性抗體F2H5結(jié)合的表位肽，結(jié)合F1抗原結(jié)構(gòu)和功能研究，確定F1抗原的候選表位，構(gòu)建了截短型鞭毛蛋白與F1候選表位的重組抗原，為下一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)評(píng)價(jià)打下了基礎(chǔ)。F1抗原中和性表位的分析鑒定有利于探索鼠疫菌致病機(jī)理，為現(xiàn)有鼠疫疫苗的使用及基于抗原表位的新型鼠疫疫苗的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

具有中和活性的抗F1單克隆抗體F2H5由本實(shí)驗(yàn)室制備[11]；感受態(tài)大腸桿菌Top10、BL21（DE3）購(gòu)自天根公司；質(zhì)粒pET-32a（+）購(gòu)自Novagen公司；含有去除186～397位氨基酸的鞭毛蛋白基因（Gen?Bank：Z15067.1，flagellin）由上海生工生物工程股份有限公司合成，并克隆至質(zhì)粒pUC57，命名為pUC57-FliCdel。

PhD-12噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自New Eng?land Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司；Pyrobest DNA聚合酶、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；PageRuler Prestained Protein Ladder購(gòu)自 Ther?mo公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司；鼠源抗His抗體購(gòu)自天根公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自MERCK公司；96孔酶聯(lián)板購(gòu)自NUNC公司；PCR引物（表1）合成與DNA測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的淘選

用 0.1 mol/L NaHCO3（pH8.6）配制 100 μg/mL的單克隆抗體F2H5，用150 μL包被ELISA微孔，4℃包被過(guò)夜，次日包被孔加滿封閉液（0.1 mol/L NaHCO3，5%脫脂奶粉，pH8.6），4℃封閉2 h，用TBST（TBS+0.1%Tween-20）洗去封閉液；用TBST稀釋原始展示文庫(kù)，使第1輪噬菌體淘選的投入量為1.0×1011，加入微孔，室溫輕輕振蕩 60 min，用TBST洗去未結(jié)合的噬菌體；用TBS配制0.1 mmol/L的F1溶液，競(jìng)爭(zhēng)洗脫微孔內(nèi)與單抗結(jié)合的噬菌體；取2 μL洗脫液測(cè)滴度，剩余洗脫液加入20 mL D600nm值為0.01～0.05的ER2738培養(yǎng)物中，37℃振蕩培養(yǎng)4.5 h；按試劑盒說(shuō)明純化擴(kuò)增后的噬菌體，測(cè)定擴(kuò)增后的噬菌體滴度，并根據(jù)該滴度估算下一輪淘選的投入量與第1輪相等；包被微孔進(jìn)行第2輪淘選，過(guò)程同第1輪，在洗板過(guò)程中Tween-20濃度提至0.5%；計(jì)算第2輪淘選洗脫物和其擴(kuò)增純化后的滴度，包被微孔進(jìn)行第3輪淘選，同第2輪；在LB/IPTG/X-gal平板上計(jì)算第3輪淘選產(chǎn)出噬菌體的滴度，噬斑用于ELISA鑒定噬菌體特異性克隆或測(cè)序。

1.3 噬菌體滴度測(cè)定

將每輪投入、產(chǎn)出的噬菌體按比例稀釋后，取不同稀釋度的噬菌體10 μL與190 μL生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期（D600nm值約0.5）的宿主菌ER2738快速混勻，室溫孵育感染5 min，加至45℃預(yù)熱的上層瓊脂中，立即混勻，將培養(yǎng)物均勻鋪滿37℃預(yù)熱的LB/IPTG/X-gal平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日，計(jì)數(shù)噬斑接近100個(gè)的平板上的噬斑數(shù)，噬斑數(shù)乘以稀釋率即得到每10 μL噬菌體的滴度-噬斑形成單位（pfu）。

1.4 ELISA鑒定噬菌體克隆特異性

將第3輪洗脫的噬菌體測(cè)定滴度后，在少于100個(gè)噬斑的平板內(nèi)隨機(jī)挑取噬菌斑擴(kuò)增，離心后收上清，即為噬菌體單克隆貯液；常規(guī)ELISA鑒定篩選到的噬菌體克??；用 0.1 mol/L NaHCO3（pH8.6）配制2 μg/mL的F2H5包被酶聯(lián)板，對(duì)照孔包被2 μg/mL的BSA，4℃濕盒過(guò)夜；封閉2 h后，單抗包被孔和對(duì)照孔分別加入100 μL擴(kuò)增的噬菌體單克隆貯液，室溫振蕩2 h；以HRP標(biāo)記的抗M13抗體為二抗，F(xiàn)2H5包被孔D450nm/D630nm值大于3倍BSA包被孔D450nm/D630nm值的克隆記為陽(yáng)性。

表1 將F1候選表位序列克隆至FliCdel的引物

1.5 F1抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA

包被與封閉同1.4，將噬菌體上清與F1等體積（各100 μL）混合，F(xiàn)1從第一孔100 μg/mL梯度稀釋，每孔噬菌體上清保持一致，最后一孔為100 μL噬菌體上清作為對(duì)照；室溫振蕩2 h，TBST洗板；加入HRP標(biāo)記的抗M13抗體，37℃孵育1 h，TBST洗板后顯色，酶標(biāo)儀測(cè)D450nm/D630nm值，F(xiàn)1競(jìng)爭(zhēng)抑制噬菌體上清與F2H5結(jié)合的抑制率可用下式計(jì)算：

1.6 純化噬菌體DNA測(cè)序模板

將競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA確定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，4℃、12 000 r/min離心10 min，向500 μL含噬菌體的上清中加入 200 μL 20%PEG/2.5 mol/L NaCl，顛倒混勻數(shù)次，室溫靜置10 min，4℃、14 000 r/min離心 10 min，棄上清；用 100 μL NaI緩沖液重懸PEG/NaCl獲得的噬菌體沉淀，加入250 μL無(wú)水乙醇，室溫孵育 10 min，4℃、14 000 r/min離心 10 min，棄上清，用0.5 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀，離心棄上清，風(fēng)干，用30 μL TE緩沖液重懸沉淀用于序列測(cè)定。

1.7 重組融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

以合成的pUC57-FliCdel質(zhì)粒為模板，通過(guò)重疊延伸PCR在FliCdel第185位氨基酸殘基的C端編碼區(qū)加入F1候選表位的基因，擴(kuò)增后重組基因的N、C端編碼區(qū)分別引入NdeⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物純化后，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，并與經(jīng)相同酶處理的表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）連接，得到重組質(zhì)粒pET32a-FliCdel、pET32a-FliCdel-1、pET32a-FliCdel-8和pET32a-FliCdel-14，能夠編碼FliCdel與F1候選表位的重組蛋白，且在C端帶有組氨酸標(biāo)簽（圖1）。

1.8 重組蛋白的表達(dá)與純化

分別挑取帶有表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）單克隆接種于適量LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐西林）中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶50的比例接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至D600nm值 為 0.8～1.0，加 入 IPTG 至 1 mmol/L，16℃ 、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)9 h，收獲菌體，7000 r/min離心8 min，沉淀重懸于80 mL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH8.0）中，于冰上超聲波裂解（超聲2.5 s，停2.5 s，35%功率），4℃、14 000 r/min離心15 min，分離上清，上樣于用Ni2+平衡的HisTrap柱（GE公司），用洗脫液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH8.0）洗脫結(jié)合于鎳柱上的重組蛋白。

1.9 SDS-PAGE與Western印跡

吸取1 mL表達(dá)培養(yǎng)物，8000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀重懸于800 μL PBS緩沖液中，于冰上超聲波裂解（超聲2.5 s，停2.5 s，35%功率）至清亮，14 000 r/min離心15 min，將上清和沉淀分離，沉淀重懸于800 μL PBS中，分別取20 μL與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻制樣，吸取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。用小鼠抗His標(biāo)簽的單克隆抗體檢測(cè)重組蛋白C端的組氨酸標(biāo)簽或抗F1的抗體F2H5進(jìn)行Western印跡分析。SDS-PAGE將重組蛋白分離后轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素（NC）膜上（恒流300 mA，1 h），電轉(zhuǎn)后的NC膜用0.1%TBST-5%脫脂奶粉封閉1 h，將膜轉(zhuǎn)入用封閉液稀釋的小鼠抗His抗體溶液，或用封閉液配制的10 μg/mL的F2H5中，室溫孵育1 h，0.1%TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，洗膜后按說(shuō)明書(shū)用化學(xué)發(fā)光試劑、CLiNX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.10 重組抗原ELISA鑒定

重組抗原從20 μg/mL濃度開(kāi)始梯度稀釋包被ELISA微孔，4℃過(guò)夜，每孔加封閉液后于37℃封閉1 h，加入 100 μL 2 μg/mL 的 F2H5 抗體，用 0.1%PBST洗板，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，0.1%PBST洗板，顯色，酶標(biāo)儀測(cè)D450nm/D630nm值。

2 結(jié)果

2.1 F2H5識(shí)別的噬菌體克隆的篩選

經(jīng)過(guò)3輪篩選，噬菌體的富集比從8.5×10-6增長(zhǎng)到1.95×10-3（表2），富集了200多倍。這意味著特異性結(jié)合F2H5的噬菌體克隆通過(guò)親和性被選擇出來(lái)。

2.2 9株與F2H5特異性結(jié)合的噬菌體單克隆

圖1 FliCdel與F1候選表位重組融合蛋白示意圖

從第3輪未擴(kuò)增的少于100個(gè)噬斑的平板上挑取噬菌體單克隆32個(gè)，用F1抗體F2H5、BSA和PA抗體鑒定各克隆的特異性，其中9個(gè)噬菌體克隆與F2H5結(jié)合而不與BSA、PA抗體和微孔板結(jié)合，認(rèn)為其是能特異性結(jié)合F1抗體的陽(yáng)性克隆。圖2為特異性鑒定的結(jié)果。

2.3 噬菌體DNA測(cè)序結(jié)果

純化噬菌體克隆 12-1、12-3、12-8、12-9、12-10、12-14、12-22、12-27、12-32的DNA序列，用引物-96 gⅢ測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析獲得噬菌體克隆攜帶的外源序列的氨基酸序列（表3），顯示這9個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆共有5種不同序列，其中FIPEVRD?PRYHP和EMPDWRYSILSP各有3個(gè)拷貝。

2.4 F1抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制噬菌體克隆與F2H5結(jié)合

對(duì)ELISA鑒定陽(yáng)性的5種不同序列的單克隆噬菌體進(jìn)行F1抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。F1可以抑制噬菌體克隆與F2H5結(jié)合，且其抑制作用隨F1抗原濃度的升高而增強(qiáng)，說(shuō)明F1抗原與噬菌體克隆之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。F1抗原在實(shí)驗(yàn)最低濃度時(shí)即顯示出對(duì)12-8、12-22、12-27的抑制（抑制率＞50%），在＞1.6 μg/mL時(shí)顯示出對(duì)12-1的抑制，而在＞64 μg/mL時(shí)才顯示出對(duì)12-14的抑制。這提示12-14與F1抗原的競(jìng)爭(zhēng)力最強(qiáng)，12-1次之，其余3株噬菌體克隆的競(jìng)爭(zhēng)力較差。此后，選擇與F1競(jìng)爭(zhēng)力分別為強(qiáng)、中、弱的3株噬菌體克隆12-14、12-1和12-8的插入肽序列作為F1的候選表位進(jìn)行重組抗原的構(gòu)建。

表2 噬菌體肽庫(kù)淘選的投入產(chǎn)出比

表3 陽(yáng)性噬菌體克隆的插入肽序列

2.5 重組抗原的可溶性表達(dá)與純化

構(gòu)建了原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pET32a-FliCdel、pET32a-FliCdel-1、pET32a-FliCdel-8、pET32a-FliCdel-14，轉(zhuǎn)化宿主菌并經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲波分離重組菌培養(yǎng)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。從圖 4 可見(jiàn)，F(xiàn)liCdel、FliCdel-1、FliCdel-8、FliCdel-14在上清中存在目的條帶，提示獲得了可溶性表達(dá)的重組蛋白。利用重組蛋白C端攜帶的組氨酸標(biāo)簽，對(duì)蛋白進(jìn)行Ni2+柱純化，電泳結(jié)果顯示可得到純度約為80%的重組蛋白（圖5）。

2.6 FliCdel-1、FliCdel-14能夠被F2H5識(shí)別

免疫印跡結(jié)果顯示，抗His標(biāo)簽的單克隆抗體可以檢測(cè)出重組蛋白 FliCdel、FliCdel-1、FliCdel-8、FliCdel-14的C端組氨酸標(biāo)簽（圖6A），證明重組融合蛋白表達(dá)成功；FliCdel-1和FliCdel-14可以被抗F1的中和抗體F2H5檢出，而FliCdel和FliCdel-8均未被檢出（圖6B），表明FliCdel-1和FliCdel-14所含表位肽能夠被F2H5識(shí)別。此外，ELISA結(jié)果（圖7）與免疫印跡結(jié)果一致。提示篩選到的肽序列可能為線性表位。

3 討論

鼠疫耶爾森菌保護(hù)性抗原F1誘導(dǎo)的免疫以體液免疫為主，在體液免疫中抗原抗體的識(shí)別具有高度的特異性，利用這種特異性，可以通過(guò)抗體分析抗原分子上的中和性表位。對(duì)已具備中和性抗體的病原體，噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)是研究中和性表位的主要方法之一。自1985年，Smith等首次建立了將多肽展示于絲狀M13衍生噬菌體表面的方法以來(lái)，噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。最初這種展示技術(shù)應(yīng)用于在免疫球蛋白上淘選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，從而繪制抗體的結(jié)合位點(diǎn)圖譜[12]，現(xiàn)已逐步發(fā)展成為發(fā)現(xiàn)具有新功能的多肽和改變已有多肽性質(zhì)的強(qiáng)大工具。

圖2 單克隆噬菌體與F2H5的反應(yīng)

我們實(shí)驗(yàn)室前期制備了鼠疫菌F1抗原的多株單克隆抗體，在動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)單抗F2H5具有中和活性[11]。在本研究中，我們利用NEB公司的線性噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)對(duì)該抗體的表位進(jìn)行了篩選，得到能與F1抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合F2H5抗體的噬菌體單克隆的肽序列FIPEVRDPRYHP和MTLDLPDL?RYGF。然而，將篩選到的噬菌體插入肽與F1抗原進(jìn)行序列比對(duì)，并未找到連續(xù)一致的氨基酸序列，但這2個(gè)肽序列與FliCdel的重組融合蛋白在免疫印跡和ELISA的結(jié)果中均顯示出能夠被F2H5單克隆抗體識(shí)別，并且該識(shí)別與插入肽序列有關(guān)，而與FliCdel無(wú)關(guān)。因此，以上結(jié)果提示我們篩選到的肽序列可能為F2H5的線性模擬表位。

圖3 F1競(jìng)爭(zhēng)抑制噬菌體克隆與F2H5的結(jié)合

圖4 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖5 重組蛋白純化后的SDS-PAGEM：蛋白marker；1：FliCdel；2：FliCdel-1；3：FliCdel-8；4：FliCdel-14

標(biāo)記有活性的單克隆抗體的表位，對(duì)了解天然的免疫反應(yīng)和設(shè)計(jì)改良的疫苗、治療方法和診斷方法是十分必要的[13]。近年來(lái)，面對(duì)高變異的病原體，如人免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、幽門螺桿菌及腦膜炎球菌等，國(guó)內(nèi)外的研究者們?cè)噲D通過(guò)已有的中和性抗體篩選中和表位，促進(jìn)基于表位疫苗的設(shè)計(jì)，從而達(dá)到表位疫苗替代完整抗原疫苗的目的。由于F1抗原的自身特點(diǎn)[14]，F(xiàn)1極易形成多聚體，影響蛋白的穩(wěn)定性，不利于其作為疫苗抗原的質(zhì)量控制，因此鑒別F1抗原的中和表位對(duì)發(fā)展新型改良的鼠疫疫苗十分必要。Tripathi和Sabhnani等根據(jù)F1抗原蛋白的親、疏水性，預(yù)測(cè)了F1抗原的B細(xì)胞、T細(xì)胞表位，并以微球作為表位的運(yùn)載體，在小鼠模型中探討了表位的有效性，其中B1T1和B2T1對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)90%[15-16]。在本研究中，我們篩選到的噬菌體插入肽與FliCdel重組表達(dá)后能夠特異性地與F1單克隆抗體結(jié)合，為研究新型鼠疫菌表位疫苗打下了一定基礎(chǔ)，但作為表位疫苗的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍面臨諸多困難。比如：采用什么方法確定有效的中和表位；如何快速準(zhǔn)確評(píng)價(jià)表位疫苗的效力；疫苗載體能否引起高效的免疫應(yīng)答等。這些不只是本研究所面對(duì)的問(wèn)題，也是表位疫苗研究中需要解決的問(wèn)題。本研究結(jié)果也提示我們，表位疫苗的設(shè)計(jì)不僅僅局限于抗原本身或其一部分，還可以通過(guò)模擬的抗原表位來(lái)實(shí)現(xiàn)。

圖6 重組蛋白的免疫印跡A：用抗His標(biāo)簽的單克隆抗體檢測(cè)；B：用抗F1中和抗體F2H5檢測(cè)；S：上清；P：沉淀

圖7 重組蛋白的ELISA鑒定

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