李 浩

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

黃曲霉毒素是一種對人和動物均有極強毒性的劇毒物質(zhì)，世界衛(wèi)生組織（WHO）早在1993年就將其劃定為Ⅰ類致癌物［1］，可誘發(fā)各種癌癥［2-3］，也是一組化學結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生化合物，主要由黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生，目前已鑒定且明確結(jié)構(gòu)的約有 17 種成分，最常見的有黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，其中黃曲霉毒素B1含量最多，且毒性和致癌性均最強。近年來，黃曲

霉毒素污染廣泛存在于中藥生產(chǎn)、貯存、運輸過程中的各個環(huán)節(jié)，故對中藥材中黃曲霉毒素含量進行準確測定，對于保障用藥安全有極其重要的意義［4-5］。目前，黃曲霉毒素常用的檢測方法有高效液相色譜（HPLC）法、酶聯(lián)免疫化學分析法、薄層色譜法、微柱篩選法、液-質(zhì)譜聯(lián)用法等［6-11］。本研究中采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜分離-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法測定中藥材中的黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，以探討檢測黃曲霉毒素更好的方法。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型高效液相色譜儀，配6410型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子化源（ESI源，美國安捷倫公司），數(shù)據(jù)由Masshunter工作站采集和分析；AE 240型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler公司）；旋轉(zhuǎn)振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；Z2064型離心機（德國Hermle公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)；黃曲霉總量（B1，B2，G1，G2）免疫親和層析柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。黃曲霉毒素混合標準品（黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，美國 Supelco 公司提供，編號 Lot：LB62461）；甲醇、乙腈均為色譜純，美國J.T.Baker提供；乙酸銨為色譜純，由美國Sigma公司提供；水為高純水；藥材樣品均由本所購買。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇 -乙腈（3 ∶2）-0.1 mmol／L 乙酸銨，梯度洗脫條件見表1；流速為0.3mL／min；柱溫為30℃；進樣量為10μL；分析時間為10 min。

表1 流動相梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：ESI離子源；掃描方式：正離子多反應監(jiān)測（MRM）模式；噴霧器40 psi；噴霧電壓4.0 kV；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速（N2）9 mL／min。為保護離子源，采用了分段掃描。質(zhì)譜參數(shù)見表2，質(zhì)譜圖見圖1。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2檢測離子對及相關參數(shù)

2.2 測定方法

精密量取黃曲霉毒素混合標準品0.5mL，用甲醇稀釋至10mL，制成混合對照品貯備液。精密量取貯備液1 mL，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至50 mL，制成混合對照品溶液。取中藥材供試品粗粉末（約5 g），加入50 mL 70%甲醇溶液，震蕩混勻20 min，然后以2 500 r／min的速率離心5 min，精密量取5 mL上清液于25 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至刻度，取經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）的續(xù)濾液 20 mL，在 3 mL ／min 的流速下通過免疫親合層析柱，加入超純水20 mL分2次淋洗親和層析柱；準確加入1.5 mL甲醇，分次洗脫免疫層析柱，洗脫液以超純水稀釋至2 mL，即得供試品溶液。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS ／MS）儀進行測定，記錄色譜圖，通過計算、分析后即得。

2.3 方法學考察

檢測限與定量限確定：將混合對照品溶液適當倍比稀釋后，進樣分析，以信噪比 S／N＝3∶1，10∶1分別確定定量限與檢測限。以黃曲霉毒素B1計，檢測限與定量限見表3。

表3 檢測限與定量限確定

圖 1 黃曲霉毒素 B1（A），B2（B），G1（C），G2（D）的二級全掃描質(zhì)譜圖及MRM總離子流圖（E）

線性關系考察：將混合對照品溶液適當倍比稀釋后，進樣分析，測定峰面積積分值，回歸分析后得相應標準曲線，見表4。結(jié)果表明，黃曲霉毒素G2和B2進樣量在0.3～30 pg、黃曲霉毒素G1和B1進樣量在1～100 pg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關系（r＞0.999 0）。

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，測定各色譜峰的峰面積值，計算相對標準偏差（RSD）。結(jié)果黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2的 RSD 分別為 2.95% ，4.51% ，6.25%，5.42%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

表4 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2線性關系考察結(jié)果

回收率試驗：添加以黃曲霉毒素 B1計為 10，2，0.5 μg ／kg 的高、中、低3個質(zhì)量濃度溶液。取中藥供試品粗粉末5 g，各加入混合對照品貯備液（黃曲霉毒素 B1含量為 50 ng ／mL）5.00，1.00，0.25 mL，分別加70%甲醇溶液至50 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，然后按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果見表5。

表 5 黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2加樣回收試驗結(jié)果（n＝9，%）

2.4 樣品含量測定

按所建立的方法分別對生檳榔、生麥芽、炒檳榔、紅花、炒牛蒡子、川牛膝、化橘紅、柏子仁進行了黃曲霉毒素殘留測定，結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測定結(jié)果（μg／kg）

3 討論

按照免疫親和柱-HPLC法制備供試品溶液時，最后的洗脫溶劑為甲醇，直接進樣時，峰形較差。需將供試品溶液轉(zhuǎn)化為流動相溶解才能改善峰形。故擬將供試品溶液在50℃下用氮氣吹干，再用流動相進行定容。

樣品前處理方法如使用含吐溫的PBS進行淋洗，因吐溫為表面活性劑，對質(zhì)譜的離子化效率有影響，并且污染離子源，降低儀器的靈敏度。故樣品前處理時對溶劑選擇應加以考慮。

考慮到供試品基質(zhì)的復雜多樣性，減少雜質(zhì)對待測組分的干擾，提高方法的適用性，通過更換不同類型色譜柱、調(diào)整流動相等進一步優(yōu)化色譜分離條件，能在快速分析的同時提高分離度，避免雜質(zhì)的干擾。

以目前的分析方法，黃曲霉毒素4個組分G2，G1，B2，B1的檢測限分別為 0.06，0.08，0.04，0.04 μg ／kg，靈敏度優(yōu)于 HPLC 法，已能滿足目前的分析需要。

由于LC-MS／MS系統(tǒng)檢測方法的通用性，可考慮目前建立的MS系統(tǒng)對其他主要真菌毒素的檢測擴展，如赭曲霉毒素等［12］。

黃曲霉毒素的前處理方法采用的凈化方式有免疫親和柱凈化［2］、Mycosep 多功能凈化柱［3］等。LC-MS ／MS 系統(tǒng)由于其檢測方法的通用性，在同一系統(tǒng)擴展檢測毒素種類，則需考慮前處理方法的通用性，包括提取、凈化方式等。

HPLC-MS／MS法可適用于較復雜基質(zhì)樣品中的多組分、低含量殘留測定。與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），氣相色譜法（GC），HPLC法等傳統(tǒng)方法比較，HPLC-MS／MS法具有速度快、靈敏度高、選擇性強、分析周期短、適用范圍廣、重復性好等優(yōu)點［13-14］，是霉菌毒素檢測的最佳確認方法。

參考文獻：

［1］Inernational Agency for Research on Cancer（IARC）.Some naturally occurring substances：Food items and constituents，heterocyclic aromatic amines and mycotoxins［R］.Lyon：IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans，1993（56）：245-395.

［2］李書國，陳 輝，李雪梅，等.糧油食品中黃曲霉毒素檢測方法綜述［J］.糧油食品科技，2009，17（2）：62-65.

［3］孫秀蘭，汪忠云，方銀軍，等.溶膠凝膠法固定抗體制備黃曲霉毒素免疫傳感器［J］.分析化學，2010，38（2）：245-248.

［4］蔡 飛，高微微，李紅玲，等.中藥上黃曲霉毒素的污染現(xiàn)狀與防除技術(shù)［J］.中國中藥雜志，2010，35（19）：2 503-2 507.

［5］黃 莉，張 浩，丁偉琴，等.中藥中真菌毒素污染問題［J］.海峽藥學，2009，21（6）：95-99.

［6］Mahoney N，Molyneux RJ.Rapid analytical method for the determination of aflatoxins in plantderived dietery supplement and cosmetic oils［J］.J Agric Food Chem，2010，58（7）：4 065-4 070.

［7］Khayoon WS，Saad B，Yan CB，et al.Determination of aflatoxins in animal feeds by HPLC with multifunctional column clean-up［J］.Food Chem，2010，118（3）：882-886.

［8］許菲菲，劉亞麗，田富饒.黃曲霉毒素檢測方法研究［J］.化學分析計量，2010，19（5）：93-94.

［9］王黎麗，周 堅.免疫學法檢測黃曲霉毒素的研究進展［J］.食品工業(yè)，2012，35（2）：121-124.

［10］Cervino C，Asam S，Knopp D，et al.Use of isotopelabeled aflatoxinsfor LC-MS ／MS stable isotope dilution analysis of foods［J］.J Agric Food Chem，2008，56（6）：1 873-1 879.

［11］Rasmussen RR，Stormi MLD，Rasmussen PH，et al.Multimycotoxin analysis of maize silage by LC-MS ／MS［J］.Anal Bioanal Chem，2010，397（2）：765-776.

［12］趙孔祥，胡筱蕓，何 佳，等.免疫親和凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定中成藥中 14 個真菌毒素 ［J］.藥物分析雜志，2012，32（5）：846-851.

［13］栗建明，李 純，顧利紅，等.快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果實類藥材中的黃曲霉毒素［J］.中國藥學雜志，2012，47（1）：65-68.

［14］鄭潤生，徐 暉，王文麗，等 .苦杏仁中黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2的液質(zhì)聯(lián)用檢測分析［J］.中國中藥雜志，2013，38（20）：3 534-3 538.