魏莉 張海文 涂芊茜 劉斌 蔡宏劍 孫春亮 陳海濤

·論著·

Bcl-2基因敲除對人胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響

魏莉 張海文 涂芊茜 劉斌 蔡宏劍 孫春亮 陳海濤

目的探討B(tài)cl-2基因?qū)θ艘认侔㏒W1990細胞增殖及凋亡的影響。方法設(shè)計并合成靶向Bcl-2基因的sgRNA(Bcl-2-sgRNA)，通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)將其結(jié)合到CRISPR載體Cas9，經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞株SW1990，篩選Bcl-2基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，以野生型SW1990細胞作為對照。采用CCK-8法測定細胞生長曲線，通過克隆形成實驗計數(shù)細胞克隆數(shù)，運用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。結(jié)果成功獲得Bcl-2基因敲除的人胰腺癌SW1990細胞株，其Bcl-2蛋白表達缺失。與野生SW1990細胞比較，敲除Bcl-2基因的SW1990細胞的生長被抑制，細胞克隆形成數(shù)量顯著減少[(160.7±10.0)個比(285.3±14.2)個]，G1期細胞比例顯著增加[(84.51±0.97)%比(57.49±1.08)%]，S期細胞比例顯著減少[(12.82±0.99)%比(27.56±1.65)%]，細胞凋亡率顯著增加[(12.67±0.59)%比(0.37±0.35)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論敲除Bcl-2基因可抑制胰腺癌SW1990細胞的生長，降低細胞克隆形成能力，使細胞阻滯在G1期，并顯著增加細胞凋亡率。

胰腺腫瘤； 基因，bcl-2； CRISPR-Cas9； 細胞增殖； 細胞凋亡

胰腺癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差，5年總生存率不到5%[1-3]，因此，探索胰腺癌的發(fā)病機制，尋找準確的治療靶點，對提高胰腺癌患者的生存率，改善其預(yù)后具有重要意義。Bcl-2(Bcell lymphoma-2)是凋亡抑制基因，在胰腺癌組織中呈高表達[4-5]，提示其參與了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究采用成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) associated proteins 9，CRISPR-Cas9]系統(tǒng)靶向敲除胰腺癌細胞Bcl-2基因，觀察其對胰腺癌細胞生物學(xué)特性的影響，以期為胰腺癌的治療提供新的靶點和策略。

材料與方法

一、插入靶向Bcl-2-sgRNA的重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過http://crispr.mit.edu網(wǎng)站設(shè)計靶向Bcl-2外顯子1的短的引導(dǎo)RNA(Bcl-2 short guide RNA，Bcl-2-sgRNA)，正義序列為5′-CACCGAGGAGAAGATGCCCGGTGCG-3′，反義序列為5′-AAACCGCACCGGGCATCTTCTCCTC-3′。同時設(shè)計鑒定CRISPR引物，正義序列為5′-TTGCTTTTCCTCTGGGAAGGATG-3′，反義序列為5′-TGGATCTCCACGACTAGCAAGCAA-3′。引物設(shè)計及合成均由上海瀚宇生物科技有限公司提供。重組質(zhì)粒的序列信息見圖1。

圖1 pX335重組質(zhì)粒示意圖

取等量合成的寡核苷酸上下游混合(10 μmol/L)，經(jīng)98℃退火后自然降至室溫(約2 h)以形成雙鏈sgRNA，應(yīng)用T4 DNA酶將雙鏈sgRNA連接到Cas9(pX335)質(zhì)粒。Cas9(pX335)質(zhì)粒為復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院吳家雪老師惠贈。連接反應(yīng)：T4 DNA 10× Buffer 1 μl，雙鏈sgRNA(10 μmol/L)4 μl，Cas9(pX335)質(zhì)粒0.5 μl，T4 DNA酶0.3 μl(紐英倫生物技術(shù)北京有限公司)，ddH2O 4.2 μl，置室溫連接1 h。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，常規(guī)培養(yǎng)18～24 h，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒DNA并測序驗證。

二、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

胰腺癌細胞株SW1990購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞接種至6孔板中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達到60%～70%時使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagen(羅氏公司)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞，按說明書操作，以未轉(zhuǎn)染的親本細胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染細胞命名為SW1990/Bcl-2-sgRNA。

Bcl-2-sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1990細胞48 h后，采用有限稀釋法，將單細胞懸液按1∶20、1∶40、1∶80稀釋濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿，待細胞長成單克隆細胞團后，用胰蛋白酶消化細胞并接種至24孔板中，細胞生長至布滿24孔板底3/4時收集細胞，裂解獲得細胞蛋白，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測敲除Bcl-2基因的SW1990細胞的Bcl-2蛋白表達以驗證Bcl-2敲除是否成功，實驗重復(fù)3次。然后將陽性克隆行PCR擴增后測序驗證。

四、CCK-8法檢測細胞生長曲線

分別取對數(shù)生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板，每孔100 μl，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入含10% CCK-8的100 μl無血清培養(yǎng)基，37℃孵箱避光孵育2 h。測各孔在450 nm波長時的吸光度值(A450值)。實驗重復(fù)3次，取均值。

五、克隆形成實驗

分別取對數(shù)生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，以每孔300個細胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 d，多聚甲醛固定60 min，結(jié)晶紫染色20 min，1×PBS清洗后晾干攝片，利用Image J(1.48V)軟件自動計數(shù)克隆數(shù)。

六、流式細胞儀測定細胞周期

分別取對數(shù)生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，PBS洗滌后再加入500 μl含50 μl/ml碘化并啶(PI)、100 μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100的PBS，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15～20 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

在缺陷分析中可以使用統(tǒng)計方法對收集的缺陷進行分類、匯總。基于不同的缺陷屬性，根據(jù)需要統(tǒng)計缺陷分布情況，利用統(tǒng)計結(jié)果分析缺陷產(chǎn)生的根本原因，將其成為改進軟件測評過程的依據(jù)。缺陷統(tǒng)計內(nèi)容包括：

七、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

分別取對數(shù)生長期SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞，PBS洗滌后調(diào)整細胞密度為1×106/ml，每100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后室溫避光放置10～15 min，離心，用結(jié)合緩沖液洗滌1次，重懸細胞于200 μl緩沖液中，加入5 μl PI(5 μg/ml)，避光放置10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、Bcl-2-sgRNA重組質(zhì)粒及穩(wěn)轉(zhuǎn)SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞株鑒定

經(jīng)測序顯示有2個不同的敲除Bcl-2基因的重組質(zhì)粒，它們的sgRNA插入序列的位置、方向及序列與預(yù)期相符，但1個重組質(zhì)粒為第1外顯子424 bp處缺失TGAACTGGG 9個堿基及435 bp處缺失1個堿基G，1個重組質(zhì)粒為第1外顯子398 bp處缺失2個堿基TG(圖2)。

圖2 2個重組質(zhì)粒的序列

2個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染的SW1990細胞的Bcl-2蛋白表達均缺失(圖3)，證明SW1990細胞Bcl-2基因靶向敲除成功。選取重組質(zhì)粒-1轉(zhuǎn)染的SW1990細胞進行后續(xù)實驗。

二、SW1990細胞增殖的變化

SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的生長較SW1990細胞緩慢，培養(yǎng)2 d后兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4、表1)，提示Bcl-2基因敲除后細胞的生長受抑制。

圖3 SW1990細胞(1)及2個SW1990/Bcl-2-sgRNA(2、3)的Bcl-2蛋白表達

圖4 SW1990及SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的生長曲線

培養(yǎng)天數(shù)SW1990SW1990/Bcl-2-sgRNAt值P值00.53±0.000.52±0.002.0340.11210.68±0.010.61±0.026.6230.00320.89±0.010.71±0.0121.0220.00031.35±0.061.08±0.065.5560.00542.24±0.071.76±0.106.8400.00253.25±0.132.52±0.195.4830.00563.64±0.182.99±0.105.5620.005

三、SW1990細胞克隆形成能力變化

SW1990細胞的克隆形成數(shù)為(285.3±14.2)個，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的克隆形成數(shù)為(160.7±10.0)個，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞克隆數(shù)較SW1990細胞顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.432，P<0.01，圖5)。

圖5 SW1990(5A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(5B)的細胞克隆

四、SW1990細胞周期的變化

SW1990 細胞的G1、S期細胞的比例分別為(57.49±1.08)%、(27.56±1.65)%；SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞比例分別為(84.51±0.97)%、(12.82±0.99)%，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的G1期細胞數(shù)較SW1990細胞顯著增加，而S期細胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為-32.32、13.23，P值均<0.01，圖6)。

圖6 SW1990(6A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(6B)細胞周期

五、細胞凋亡的變化

SW1990細胞的凋亡率為(0.37±0.35)%；SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞為(12.67±0.59)%，SW1990/Bcl-2-sgRNA細胞的凋亡率顯著高于SW1990細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=54.74，P<0.01，圖7)。

圖7 SW1990(7A)及SW1990/Bcl-2-sgRNA(7B)的細胞凋亡

細胞凋亡可清除機體發(fā)育不正常的細胞及衰老細胞，以維持機體各器官及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。細胞凋亡的下調(diào)或者功能失控會引起腫瘤的發(fā)生。細胞凋亡分為內(nèi)源性(線粒體)途徑及外源性(死亡受體)途徑，內(nèi)源性途徑主要通過p53、Bcl-2家族協(xié)助凋亡信號的啟動；外源性途徑主要通過激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)從而促進細胞凋亡[6]。Bcl-2是凋亡抑制基因之一，屬于癌基因家族成員，位于18號染色體長臂21區(qū)，全長720 bp，由3個外顯子、2個啟動子及2個內(nèi)含子組成，編碼一種細胞跨膜蛋白，含有293個氨基酸，分子質(zhì)量約為26 000，主要定位于線粒體、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜。Bcl-2基因由18號染色體易位到14號，與免疫球蛋白重鏈基因并列相連，導(dǎo)致基因過表達[7]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白可在淋巴瘤、乳腺癌、白血病、滑膜肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等多種腫瘤組織中表達上調(diào)[8-15]。

基因敲除是一種遺傳工程基因修飾技術(shù)，它針對某個遺傳基因，運用一定的生物學(xué)技術(shù)使其特定的功能缺失，通過可能對相關(guān)生命現(xiàn)象造成的影響推測該基因的生物學(xué)功能。傳統(tǒng)基因敲除主要利用RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN等系統(tǒng)，通過插入突變和基因靶向技術(shù)使目的基因的功能喪失，而CRISPR-Cas系統(tǒng)是利用與目的基因具有同源性的sgRNA特異性結(jié)合到基因組DNA，成為一種新型的基因組編輯工具，具有操作便捷、效率高、成本低、可同時沉默任意數(shù)量的單個基因等優(yōu)點，已在原核的遺傳學(xué)研究、抗病毒和生物技術(shù)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，表現(xiàn)出較強的基因組編輯活性[16]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是一些細菌和古菌在噬菌體長期選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機制之一，它由一個成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)和附屬的蛋白質(zhì)(Cas)組成[17]。CRISPR-Cas系統(tǒng)依據(jù)主要的核心組成元件和序列可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中Ⅱ型來源的Cas9蛋白表現(xiàn)出非常強的DNA裂解活性。在菌體內(nèi)，CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA，然后在tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)-Cas9復(fù)合物加工后生成CRISPR RNA，CRISPR RNA 的5′端能與靶位點互補配對， 3′端能與tracrRNA-Cas9蛋白形成復(fù)合物，識別結(jié)合外源DNA特定序列，特異性地切割靶位點，沉默內(nèi)源基因的表達[18]。

本研究建立了Bcl-2基因敲除的人胰腺癌SW1990細胞株。Bcl-2基因敲除后的細胞生長受到抑制，克隆形成數(shù)量減少， G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，同時細胞凋亡率增加，證實Bcl-2基因在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，提示Bcl-2基因可作為臨床治療的新靶點。

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(本文編輯：呂芳萍)

2015年第二屆天津胰腺疾病高峰論壇通知

由中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病學(xué)專業(yè)委員會主辦，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院、《中華胰腺病雜志》雜志社和《武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)》雜志社聯(lián)合承辦的“2015年天津胰腺疾病高峰論壇”將于2015年10月17日在天津召開。本次論壇將邀請包括李兆申教授在內(nèi)的全國知名專家、教授進行有關(guān)急性胰腺炎的最新理論技術(shù)的介紹和交流，包括復(fù)發(fā)性急性胰腺炎診治進展、重癥急性胰腺炎的內(nèi)科、外科和營養(yǎng)治療等內(nèi)容。

本次論壇免注冊費，參會代表均可獲得國家級繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育Ⅰ類學(xué)分5分，熱烈歡迎同道們參加！

聯(lián)系地址：天津市河?xùn)|區(qū)成林道220號 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰脾中心；郵編：300162。

聯(lián)系人：牛海艷，手機13752207803，Email：13752207803@163.com，有意參會者請通過短信或郵件提供姓名、性別和單位等基本信息。

Effects of knocking out Bcl-2 gene on proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer cells SW1990

WeiLi,ZhangHaiwen,TuQianqian,LiuBin,CaiHongjian,SunChunliang,ChenHaitao.

DepartmentofOncology, 401HospitalofPLA,Qingdao266071,China

SunChunliang,Email:sunchunliang5366@sina.com;ChenHaitao,Email:medchenhaitao@163.com

Objective To investigate the effect of Bcl-2 gene expression on the proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer SW1990 cells. Methods Bcl-2 short guide RNA (Bcl-2-sgRNA) was designed and synthesized, and it was combined with CRISPR-Cas 9. After confirmation by gene sequencing, it was transfected into human pancreatic cancer cell line SW1990, then the cells with stable Bcl-2 gene knock-out were selected, and wild type SW1990 cells were used as control. The cell growth curve was determined by CCK-8 method. The number of clone formation was measured. Flow cytometry was used to measure cell cycle and apoptosis. Results Human pancreatic cancer cell line SW1990 with Bcl-2 gene knock-out was successful constructed. Compared with wild type SW1990 cells, the growth of SW1990 cells with Bcl-2 gene knock-out was inhibited, the number of clone formation was significantly decreased [(160.7±10.0)vs(285.3±14.2)], the proportion of G1cells was significantly increased [(84.51±0.97)%vs(57.49±1.08)%], the proportion of S phase cells significantly decreased [(12.82±0.99)%vs(27.56±1.65)%], and apoptosis rate was remarkably increased [(12.67±0.59)%vs(0.37±0.35)%], and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). Conclusions Knock-out of Bcl-2 gene can inhibit the growth of human pancreatic cancer cell line SW1990, decrease the ability of clone formation, block the cell in G1phase and greatly increase cell apoptosis rate.

Pancreatic neoplasms； Genes, bcl-2； CRISPR-Cas9； Cell proliferation； Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.04.005

266071 青島，解放軍第401醫(yī)院腫瘤科(魏莉、張海文、劉斌、蔡宏劍)，普外科(孫春亮)；第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院老年病科(涂芊茜、陳海濤)，消化內(nèi)鏡中心(陳海濤)

陳海濤，Email：medchenhaitao@163.com；孫春亮，Email：sunchunliang5366@sina.com

2015-04-08)