陳圖鋒，高文華*，唐 敏

(1.汕頭大學(xué) 分析測(cè)試中心，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學(xué) 化學(xué)系，廣東 汕頭 515063)

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高效液相色譜法測(cè)定藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含量

陳圖鋒1,2，高文華1,2*，唐 敏2

(1.汕頭大學(xué) 分析測(cè)試中心，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學(xué) 化學(xué)系，廣東 汕頭 515063)

目的：建立以高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SUPELCO Discovery C18HPLC Column (25cm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.03%磷酸溶液，采用梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，楊梅素和二氫楊梅素檢測(cè)波長分別為373nm和290nm。結(jié)果：藤茶中二氫楊梅素和楊梅素分別在0.15～94.0mg·L-1(R2=1)和0.62～77.50mg · L-1(R2=0.999 7)濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系；平均加標(biāo)回收率分別為89.7%、93.5%，RSD<4.5%。結(jié)論：該法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于藤茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及其質(zhì)量控制。

藤茶；二氫楊梅素；楊梅素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

藤茶(Ampelopsisgrossedentata)又名山甜茶、眉茶、白茶、龍須茶、溪黃草等，屬于葡萄科蛇葡萄屬中的顯齒蛇葡萄，是一種野生藤本植物[1]。研究表明，黃酮類化合物是藤茶的主要活性成分[2-3]，含量高達(dá)38%以上，其中二氫楊梅素與楊梅素含量最高[4]。二氫楊梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、降低血脂和血糖水平，提高SOD活性等特殊功效[5]。楊梅素具有抗腫瘤、降低神經(jīng)毒性、降血糖、保肝護(hù)肝、抗突變、預(yù)防齲齒等多種藥理活性[6-7]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于藤茶的質(zhì)量監(jiān)控僅以測(cè)定二氫楊梅素含量為主，主要有HPLC[8]和紫外-可見分光光度法[9]。紫外-可見分光光度法適于大類成分的含量測(cè)定，如總黃酮、總蒽醌、總生物堿等。本試驗(yàn)采用HPLC-DAD雙波長同時(shí)檢測(cè)二氫楊梅素和楊梅素含量，以期為藤茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，G1315B DAD檢測(cè)器，ChemStation for LC 3D Rev.A.10.01[1635]工作站，METTLER TOLEDO AL204電子天平，Millipore Milli-Q50 純水器，上?？茖?dǎo)超聲儀器SK2200HP超聲波水浴，上海大普儀器PHS-3CA型精密酸度計(jì)。

1.2 試劑

甲醇(TEDIA)；乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丙酮(廣東西隴化工)；石油醚(30～60℃)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(廣州試劑三廠)；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；藤茶樣品(恩施綠神(中港合資)生物制品有限公司)；楊梅素對(duì)照品(阿拉丁，批號(hào)：21487)；二氫楊梅素對(duì)照品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所)；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 色譜條件

色譜柱：SUPELCO Discovery C18HPLC Column (25cm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫(0min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88，25min比例為65∶35；30～40min，比例為12∶88)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃；波長：二氫楊梅素(290nm)、楊梅素(373nm)；進(jìn)樣量：5μL。在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，二氫楊梅素和楊梅素的色譜見圖1。

圖1 二氫楊梅素、楊梅素對(duì)照品色譜

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取楊梅素1.55mg，二氫楊梅素1.88mg，分別置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液濃度為155mg· L-1，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液濃度為188mg·L-1，待用。

分別量取上述配制好的楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液和二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液各5mL，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。得楊梅素77.5mg· L-1、二氫楊梅素94mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，待用。

1.5 樣品處理

1.5.1 楊梅素待測(cè)液 取樣品藤茶，精確稱量0.500g，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。超聲提取30min，過0.45μm的濾膜過濾，此為楊梅素待測(cè)液。

1.5.2 二氫楊梅素待測(cè)液 取0.5mL“1.5.1”項(xiàng)中制備的楊梅素待測(cè)液于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，過0.45μm的濾膜過濾，此為二氫楊梅素待測(cè)液(由于藤茶中二氫楊梅素含量較高，所以需要稀釋)。藤茶樣品色譜見圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇

稱取0.5g的藤茶樣品，置于10mL容量瓶中，分別比較了甲醇、乙醇、石油醚、丙酮等提取溶劑，結(jié)果表明，以甲醇作為提取溶劑，超聲提取時(shí)間為30min，可獲得良好的提取效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化和選擇

2.2.1 最適波長選擇 對(duì)二氫楊梅素峰和楊梅素峰在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明二氫楊梅素在205nm和290nm 處吸收值高，而楊梅素在208nm和373nm 處吸收值高，考慮到在205nm和208nm處樣品的干擾較大，因此選擇290nm作為二氫楊梅素的檢測(cè)波長，373nm作為楊梅素的檢測(cè)波長。

圖2 藤茶樣品色譜

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 楊梅素和二氫楊梅素在不同pH值下具有不同的穩(wěn)定性[10-11]，當(dāng)pH≥9.0時(shí)二氫楊梅素會(huì)因處于堿性環(huán)境而發(fā)生自動(dòng)氧化作用,生成了其它成分；楊梅素在堿性條件下穩(wěn)定性極差。所以本實(shí)驗(yàn)選用乙酸-甲醇和磷酸-甲醇作為流動(dòng)相，并對(duì)pH=2.0、2.5、3.3、4.4、5.5、6.4時(shí)的譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果表明采用甲醇-0.03%磷酸，0.03%磷酸pH值為2.5較好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

根據(jù)“1.4”項(xiàng)中配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)母液濃度，逐級(jí)稀釋配制成楊梅素、二氫楊梅素濃度為(77.5mg· L-1，94.0mg·L-1) (15.5mg·L-1，18.8mg·L-1)，(3.1mg·L-1，3.76mg·L-1)，(0.62mg·L-1，0.752mg·L-1)，(0.124mg·L-1，0.150 4mg·L-1)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次從低濃度到高濃度，按“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每一濃度連續(xù)測(cè)定3次，以峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得楊梅素回歸方程：Y=14.104X -10.055(R2=0.999 7)，二氫楊梅素回歸方程：Y=15.27X +0.991 4(R2=1)，表明楊梅素在0.62～77.50mg·L-1、二氫楊梅素在0.15～94.00mg·L-1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.4 最低檢出限

2.4.1 楊梅素最低檢出限 取楊梅素濃度為0.62mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3mL于5mL容量瓶中，按“1.3”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得信噪比為3時(shí)，楊梅素最低檢出限為20mg·kg-1。

2.4.2 二氫楊梅素最低檢出限 取二氫楊梅素濃度為0.15mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得信噪比為3時(shí)，二氫楊梅素的最低檢出限為240mg· kg-1。

2.5 回收率試驗(yàn)

向空白樣品中加入3種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次，得到其回收率，見表 1。

表1 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明，高、中、低濃度的加標(biāo)回收率均在88.00%以上，RSD<4.5%，符合要求。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)中楊梅素、二氫楊梅素分別為(15.5mg·L-1，18.8mg·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行精密度檢測(cè)，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10次，測(cè)得峰面積。分別得到楊梅素和二氫楊梅素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.93%、1.17%，符合要求。

2.7 藤茶中楊梅素和二氫楊梅素含量的測(cè)定

采用本方法對(duì)藤茶樣品進(jìn)行檢測(cè)，最終測(cè)得楊梅素含量為6.73mg·g-1，二氫楊梅素含量為135.2mg·g-1。

3 結(jié)論

藤茶中楊梅素和二氫楊梅素分別在0.62～77.50mg·L-1和0.15～94.00mg·L-1濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為93.5%、89.7%，RSD<4.5%。結(jié)果表明該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可為藤茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒補(bǔ)編(第二冊(cè))[M].北京:科學(xué)出版社,1979:353.

[2] 李剛,鄭作文.藤茶總黃酮含藥血清對(duì)2215細(xì)胞分泌乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響研究[J].中國藥房,2008,19(18)：1366.

[3] 李剛,鄭作文,唐云麗.藤茶總黃酮體外抗人肝癌細(xì)胞作用研究[J].中國藥房,2008,19(9)：652.

[4] 覃沽萍,許學(xué)鍵,李劍江.廣西瑤族藤茶化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,9(4)：41.

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[6] 張秀娟,黃清玲,季宇彬.楊梅素的藥理活性研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2008,20(5):57-60.

[7] 臧寶霞,金鳴,吳偉，等.楊梅素對(duì)血小板活化因子拮抗的作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,38(11):831-833.

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[11] 王志江.楊梅素的穩(wěn)定性研究[J].廣東微量元素科學(xué),2008,15(10):37-40.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Content Determination of Dihydromyricetin and Myricetin in Leaves ofAmpelopsisGrossedentataby HPLC

Chen Tufeng1,Gao Wenhua1，2*，Tang Min2

(1.Analysis & Testing Center,Shantou University,Guangdong 515063, China； 2.Department of Chemistry, Shantou University, Guangdong 515063, China )

Objective:To develop a method for the content determination of dihydromyricetin(DMY) and myricetin(MY)in leaves ofAmpelopsisgrossedentata.Methods:HPLC method was adopted.The separation was performed on SUPELCO Discovery C18 (25cm×4.6mm,5μm)column with 0.03% phorsphoric acid-methanol as mobile phase at flow rate of 0.8 mL·min-1.The detection wavelength of MY was set at 373 nm，and that of DMY was set at 290 nm. Results:The linear range was 0.15～94mg·L-1(R2=1)for DMY and 0.62～77.50mg·L-1(R2=0.999 7) for MY with average recovery of 89.7% and 93.5%,RSD<4.5%. Conclusion:The method is simple,fast,accurate aprovide the basis for the quality standard of leaves ofA.grossedentata.

Leaves ofAmpelopsisgrossedentata；Dihydromyricetin；Myricetin；HPLC；Content Determination

2014-08-20

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2011010005208);廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2013KJCX0078)

陳圖鋒(1978-)，男，廣東省汕頭大學(xué)分析測(cè)試中心助理工程師，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。

高文華(1968-)，男，博士，廣東省汕頭大學(xué)教授，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail: whgao@stu.edu.cn

R284.1

A

1673-2197(2015)01-0028-02

10.11954/ytctyy.201501014