陳 梁，楊志宏

(內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院 腫瘤科，內(nèi)蒙古 烏海 016000)

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金粟蘭在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機制研究

陳 梁，楊志宏

(內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院 腫瘤科，內(nèi)蒙古 烏海 016000)

目的：探討金粟蘭倍半萜內(nèi)酯類化合物LSE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機制。方法：利用蛋白印記法檢測表皮生長因子(EGF,25ng/mL)誘導人乳腺癌細胞上皮間質轉化(EMT)前后及不同LSE-3作用EMT細胞48h后，間質標記物Snail、Slug以及LSE-3可能作用的其它靶點如p53等相關信號分子蛋白表達情況。結果：蛋白印記對Snail、Slug、p53蛋白表達量檢測結果顯示，與EGF誘導組相比，人乳腺癌細胞中Snail、Slug蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)，p53蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，且都與LSE-3呈劑量依賴關系。結論：LSE-3能逆轉EGF誘導的人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)上皮間質轉化的產(chǎn)生,降低發(fā)生了EMT的人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的侵襲轉移能力。

金粟蘭、LSE-3、乳腺癌細胞、作用機制

金粟蘭又名珠蘭、魚子蘭、茶蘭等，原產(chǎn)我國南部，喜溫暖、潮濕和通風的環(huán)境，多生于山坡、溝谷密林下。半灌木，直立或稍平臥，高30～60cm。金粟蘭生性強健，容易栽培，用分株、扦插和壓條繁殖皆可。全株入藥，有活血驅蟲、祛風濕、接筋骨之效。但目前最新研究發(fā)現(xiàn)金粟蘭倍半萜內(nèi)酯類化合物LSE-3在抑制腫瘤方面有很好的療效，故本文采用兩株人乳腺癌細胞作為研究對象，探討LSE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機制。

1 實驗材料與儀器

1.1 主要實驗儀器

細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，MCO-750C02)、倒置熒光顯微鏡(Leica公司)、三蒸水發(fā)生器(上海亞榮生化儀器廠)、液氮生物容器(四川亞西生物容器有限公司，YDS-35-125)、醫(yī)用超凈工作臺(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司)、臺式高速冷凍離心機(Thermo公司)、Western blotting電泳儀、Western Blot電轉儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 主要實驗材料與試劑

從本實驗室當年收獲的寬葉金粟蘭、多穗金粟、絲穗金粟蘭和植物腫節(jié)風這四種金粟蘭科植物中提取得到LSE-3。MDA-MB-231細胞、MDA-MB-468細胞(人乳腺癌細胞株購于協(xié)和細胞庫中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心)，使用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基(Gibco,41300-039)；重組人表皮生長因子EGF( 購于美國PeproTech公司，產(chǎn)品批號：0212AFC05)；M-PER即Mammalian Protein Extraction Reagent(蛋白提取試劑, Thermo公司：78503)，鼠抗人β-actin單克隆內(nèi)參一抗(anbo生物技術公司)、HRP標記山羊抗兔二抗(北京全式金生物技術有限公司)、HRP標記山羊抗鼠二抗(北京全式金生物技術有限公司)；鼠抗人p53單克隆一抗、兔抗人Snail單克隆一抗、兔抗人Slug單克隆一抗(美國Cell Signaling公司)。

2 試驗方法

2.1 實驗分組

設置含25ng/mL的LSE-3藥組(0.5μg/mL,1μg/mL, 3μg/mL,10μg/mL)；25ng/mL EGF組與空白組(無EGF)，收集對數(shù)期細胞若干瓶，制成細胞懸液，調(diào)整細胞懸液密度為6×106個/mL；將上述細胞懸液分別加入六個直徑為10cm的無菌培養(yǎng)皿中，分組培養(yǎng)。

2.2 蛋白樣品制備

按照提取蛋白試劑盒的方法提取細胞內(nèi)蛋白。

2.3 檢測Snail、Slug、p53蛋白表達

使用Western Blot方法檢測各蛋白的表達量。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 Snail、Slug在各腫瘤細胞株內(nèi)的表達

Western Blot結果顯示(見圖1)，隨LSE-3給藥濃度的增加，Sanil、Slug在兩株細胞內(nèi)的表達均下調(diào)，與給藥濃度呈現(xiàn)一定的依賴關系；以β-actin蛋白為內(nèi)參，如圖2顯示，給藥組的Snail、Slug的相對表達量與模型組(EGF組)的相對表達量比較差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 Snail、Slug蛋白在各乳腺癌細胞中的相對表達量

圖2 I：Snail的相對表達量；II：Slug的相對表達量

3.2 p53在各細胞中的表達

陳雁[1]在研究中發(fā)現(xiàn)，p53參與了皮膚腫瘤發(fā)生EMT進程，并認為p53是一個調(diào)控EMT的重要“關卡”。實驗結果顯示(見圖3)，LSE-3對MDA-MB-231、MDA-MB468這兩株腫瘤細胞作用48h后，細胞內(nèi)p53的表達均隨著LSE-3濃度的增加而上調(diào)；如圖4所顯示，以β-actin蛋白表達量為內(nèi)參，各給藥組與模型組(EGF組)相比，其p53的表達量具有顯著性差異(P<0.05)。

4 討論

金粟蘭多具有抗菌消炎，散棄活血的功效，通常用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、骨折、風濕性關節(jié)炎等[2]，在民間是治療腫癤，毒蛇咬傷和跌打損傷的良藥。該屬植物的一些化學成分具有良好的細胞毒作用和抗菌活性[3]?，F(xiàn)代藥理實驗表明金粟蘭屬植物多具有抗菌、抗腫瘤、增強免疫、抗病毒、抗?jié)?、?zhèn)痛、抗血小板聚集、收縮子宮等活性[4]。金粟蘭屬作為我國分布較全并且特有存在的種屬，目前其研究與開發(fā)尚不深入，仍有很多問題有待研究探討，如該屬與其近緣屬草珊瑚屬在化學成分和藥理作用方面的異同，由金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚中分離得到的抗菌抗腫瘤的有效成分等。本文通過人的乳腺癌細胞研究了金粟蘭內(nèi)倍半萜內(nèi)酯類化合物LSE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機制。

圖3 p53蛋白在各乳腺癌細胞中的相對表達量

圖4 p53蛋白在各乳腺癌細胞中的相對表達量

Snail、Slug均屬于Snail家族成員，是均含有鋅指結構的DNA結合蛋白，也是間質細胞標志分子。大多研究顯示，雖然誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT化的因素各不相同，這些誘因包括生長因子、細胞外基質、蛋白酶及缺氧等，但是其發(fā)生EMT的過程是相似的，而Snail轉錄因子便是在調(diào)節(jié)上皮間質轉化過程中各種信號轉導的共同下游靶基因，目前所已知的EMT的過程中幾乎都與Snail的激活有關。Snail與Slug在腫瘤細胞EMT過程中扮演了至關重要的角色，被當作分子靶向逆轉EMT的重要性不容忽視，而本實驗結果證實，LSE-3能夠明顯抑制其在人乳腺癌腫瘤細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)中的表達。

p53是調(diào)控細胞周期的重要蛋白，尤其是在細胞受到損傷后，能通過調(diào)控與細胞周期、凋亡相關的基因，使細胞周期發(fā)生阻滯，直到細胞修復損傷為止。目前關于其研究集中在對細胞周期、細胞凋亡和基因穩(wěn)定性等方面的作用[5]。腫瘤界對p53與EMT之間關系的研究才剛剛起步，兩者之間的調(diào)控機制及關系還不確切，因此可能是今后尋找逆轉腫瘤EMT化作用的一個全新的靶點，也需要更多的研究與理論來闡述此問題。

LSE-3抗人乳腺癌EMT的機制是多途徑、多靶點綜合作用的結果，并且始終貫穿腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲與轉移等多個過程。但是這種逆轉作用是以蛋白水平為主，還是以轉錄水平為主要作用，或者是在EMT發(fā)展的過程中對不同發(fā)展階段有著不同的調(diào)控機制并不清楚，需要采用更豐富的實驗手段和更為嚴密的實驗設計進一步研究和證實，這也是本課題下一步研究的重點與方向。深入了解與研究其介導的機制，可為將LSE-3作為抑制腫瘤藥物的開發(fā)提供更多的證據(jù)，同時也為開發(fā)更多相關藥物提供有價值的參考。

[1] CHAMBERS AF, GROOM AC, MACDONALD IC. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sitesr[J]. Nature Reviews Cance，2002(2):563-572.

[2] 李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1982;820.

[3] 吳征銳，周太炎，肖培根.新華本草綱要[M].上海:上?？茖W技術出版社，1991：64.

[4] KAWABATA J，F(xiàn)UKUEHI Y, TEHARA S, et al. Strictures quiterpene alcohols from Chloranthus japonicas of novel ees-Agric [J].Biol Chem，1984,48(3)：713.

[5] ZHIVOTOVSKY B, KROEMER G. Apoptosis and genomic instability[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(9):752-762.

(責任編輯：魏 曉)

2014-09-02

陳梁(1972-)，男，內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向為腫瘤內(nèi)科放化療。

R246.5

A

1673-2197(2015)01-0009-02

10.11954/ytctyy.201501005