潘 虹，王 帥，孟憲生* ，包永睿

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室， 遼寧 大連 116600)

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基于HepG2、SMMC-7721肝癌細胞生長抑制的雞血藤總黃酮純化前后藥效對比研究

潘 虹1，2，3，王 帥1，2，3，孟憲生1，2，3*，包永睿1，2，3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室， 遼寧 大連 116600)

目的：探討雞血藤總黃酮純化前后對HepG2和SMMC-7721肝癌細胞藥效對比的影響；明確雞血藤抗肝癌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：以肝癌細胞抑制率為評價指標，將純化前后不同劑量的雞血藤總黃酮分別作用于HepG2和SMMC-7721兩株肝癌細胞24h、36h、48h后，采用MTT法檢測其對兩株肝癌細胞抑制情況。結(jié)果：雞血藤純化前后的總黃酮均能夠顯著抑制肝癌HepG2和SMMC-7721肝癌細胞的增殖。相同給藥時間內(nèi)，純化后的雞血藤總黃酮對肝癌細胞的抑制率均大于未純化的雞血藤黃酮抑制率。此外，無論純化前與后，其抗肝癌作用隨著時間和劑量的增加而增強，呈現(xiàn)顯著的時-效、量-效關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：通過體外藥效學(xué)比較，顯示雞血藤總黃酮純化后藥效優(yōu)于純化前藥效，表明雞血藤總黃酮是雞血藤抗肝癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，為雞血藤在治療肝癌方面的發(fā)展及臨床合理利用奠定基礎(chǔ)。

雞血藤總黃酮；肝癌；藥效對比；HepG2細胞；SMMC-7721細胞

雞血藤為豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤莖[1]。 在我國主要分布在廣西云南等地，其性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有活血補血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)之功效。用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等癥[2]。現(xiàn)代研究表明，雞血藤具有改善血流量、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤、抗病毒的功效[3]。大量文獻報道，雞血藤總黃酮是其抗腫瘤的主要活性成分[4]。本實驗采用MTT法檢測雞血藤黃酮純化前后作用于HepG2和SMMC-7721兩株肝癌細胞的藥效，不僅證明了雞血藤對肝癌具有治療作用，而且明確了雞血藤總黃酮是雞血藤治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為雞血藤的藥用價值及在治療肝癌方面的研究提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑

雞血藤藥材(購自陽光大藥房，產(chǎn)地：河北)；雞血藤總黃酮(由本實驗提取純化，純度>80%)；RPMI-1640培養(yǎng)粉、DMEM培養(yǎng)粉、四甲基偶氮唑鹽 (MTT)(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素(哈藥集團制藥總廠，批號： A081100207)；鏈霉素(大連美羅大藥廠，批號：65081216)；水為高壓滅菌水。

1.2 儀器

CP225D電子分析天平(德國Sartorius，十萬分之一)；MiLLi-Q超純水處理裝置(美國MiLLipore公司)；NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國NUAIRE公司)；AE31型倒置相差顯微鏡(Motic公司)；HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；Sunrise 型酶標儀(奧地利Tecan公司)。

1.3 實驗瘤株

人肝癌細胞株HepG2和SMCC-7721，購于上海拜力生物科技有限公司。

2 方法及結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細胞株，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100IU·mL-1)中，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)[5]。

人肝癌SMMC-7721細胞株，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100IU·mL-1)中，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)[6]。

2.2 雞血藤純化前干膏粉末制備

取雞血藤藥材5g，加入30倍量50%乙醇回流提取2次，每次1.5h。將提取液濃縮揮干，減壓干燥得雞血藤純化前干膏粉末，備用。

2.3 雞血藤純化后干膏粉末制備

雞血藤提取液經(jīng)過大孔吸附樹脂AB-8吸附，上樣濃度為0.2g·mL-1，提取液調(diào)至pH=3，用6倍柱體積的70%乙醇以1mL·min-1的速度洗脫。通過UV測得總黃酮含量，計算純度達到80%以上。將洗脫液濃縮揮干，減壓干燥得雞血藤純化后干膏粉末，備用。

2.4 含藥培養(yǎng)液的制備

取雞血藤純化前后干膏粉末各10mg分別溶于5mL培養(yǎng)液中，加入2‰DMSO助溶，過0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

2.5 MTT 試驗

取處于對數(shù)生長期的HepG2和SMMC-7721細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置五個組別，即空白組、加藥25μL組、加藥50μL組、加藥75μL組、加藥100μL組，加藥后其余體積均用相應(yīng)的培養(yǎng)液補至200μL。每組設(shè)置5個復(fù)孔，于37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24h、36h、48h。每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入150μL DMSO孵育10min溶解，于酶標免疫測定儀測定492nm處的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率[7-9]。

細胞的抑制率=(1-試驗組OD/對照組OD)×100%

2.6 結(jié)果

2.6.1 雞血藤總黃酮純化前不同濃度與不同時間對HepG2細胞吸光度及增殖的影響 雞血藤總黃酮純化前后對HepG2細胞吸光度結(jié)果見表1、表2。

2.6.2 雞血藤總黃酮純化后不同濃度與不同時間對SMMC-7721細胞吸光度及增殖的影響 雞血藤總黃酮純化前后對SMMC-7721細胞吸光度結(jié)果見表3、表4。

表1 雞血藤總黃酮純化前后對HepG2細胞吸光度結(jié)果 (±s)

注：每株細胞均與各自對照組比較，*P<0.05。

表2 雞血藤總黃酮純化前后對HepG2肝癌細胞株的增長抑制作用結(jié)果 (%)

表3 雞血藤總黃酮純化前后對SMMC-7721細胞吸光度結(jié)果 (±s)

注：每株細胞均與各自對照組比較，*P<0.05。

表4 雞血藤總黃酮純化前后對SMMC-7721肝癌細胞株的增長抑制作用結(jié)果 (%)

通過MTT法檢測結(jié)果顯示：無論純化前還是純化后的雞血藤總黃酮對HepG2和SMMC-7721兩株肝癌細胞均有抑制作用，但抑制程度不同，24h、36h、48h雞血藤純化后的黃酮作用于肝癌細胞的抑制率明顯大于純化前。而且從表中可以看出，雞血藤黃酮純化前后對肝癌細胞的抑制率均隨時間延長和藥物劑量增加而逐漸增強，呈現(xiàn)顯著的時-效、量-效關(guān)系(P<0.05)。

3 討論

雞血藤是常用的養(yǎng)血活血藥物，中醫(yī)臨床用于治療腫瘤中晚期病人的血瘀證[10]。然而，近年來關(guān)于雞血藤抗腫瘤的研究，大多針對于肺腫瘤，提示雞血藤總黃酮對肺癌A549抑制效果較好[11]。本實驗針對雞血藤總黃酮對在治療肝腫瘤作用方面影響，選取了人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721細胞株，發(fā)現(xiàn)其對肝癌細胞抑制效果顯著，表明了雞血藤不僅僅可以治療肺癌，對肝癌也有很好的治療效果。

從MTT法檢測到的細胞抑制率結(jié)果看出，未純化的雞血藤黃酮作用于兩株細胞24h后，抑制率在30%左右，純化后的雞血藤黃酮作用于兩株細胞24h后，抑制率達到了50%以上；作用時間延長至48h后，純化前的抑制率達到50%左右，然而純化之后的抑制率增大到了80%。明顯可以看出，純化后雞血藤黃酮藥效明顯優(yōu)于純化之前的，且藥效顯著，這充分說明雞血藤總黃酮確實是其抗肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，為雞血藤治療肝癌方面的深入研究起到了指導(dǎo)性作用。此外，雞血藤總黃酮在給藥劑量范圍內(nèi)對肝癌細胞的抑制率隨時間延長和藥物劑量增加而逐漸增強，呈現(xiàn)顯著的時-效、量-效關(guān)系(P<0.05)，可為臨床合理用藥提供參考。

近年來肝癌的發(fā)病率仍處于世界癌癥發(fā)病率排行前列，高昂的治療費用給患者本身、家庭、社會和國家增加了經(jīng)濟負擔(dān)，因此開發(fā)治療肝癌高效、經(jīng)濟的中草藥具有很高的價值和意義。雞血藤價格低廉，本實驗經(jīng)過體外實驗驗證雞血藤確實有抗肝癌細胞的作用，且發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)已經(jīng)明確，為抗肝癌新藥的研發(fā)及雞血藤的有效利用奠定了堅實基礎(chǔ)。

[1] 王宏，劉藝娜，曾祖平，等．雞血藤抗腫瘤活性部位SSCE指紋圖譜的研究[J]．中國中醫(yī)雜志，2011，36(18)：2525-2528．

[2] 國家藥典委員會．中國藥典(一部) [S]．北京：中國醫(yī)藥科技出版杜，2010：180．

[3] 符影，程悅，陳建萍，等．雞血藤化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J]．中草藥，2011，42(6)：1229-1233．

[4] 唐勇，何薇，王玉芝，等．雞血藤黃酮類組分抗腫瘤活性研究[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13(2)：51-54．

[5] 費洪新，孫麗慧，張濤，等．人肝癌HepG2細胞培養(yǎng)的體會[J]．衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25(8)：138．

[6] 包永睿，楊欣欣，孟憲生，等．四味肝泰軟膠囊對人肝癌細胞株SMCC-7721細胞周期及凋亡影響的初步研究[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(1)：8-10．

[7] 魏一萌，王帥，孟憲生，等．基于SMMC-7721肝癌細胞生長抑制的兩種敗醬草藥效比較及提取方法研究[J]．中國醫(yī)藥科學(xué)，2013，3(11)：35-37．

[8] 周春權(quán)，林靜瑜，姚欣，等．藤茶總黃酮體外抗腫瘤實驗研究[J]．中國醫(yī)藥科學(xué)，2012，2(9)：50-51．

[9] 張云坤，包永睿，孟憲生，等．藏藥余甘子抗腫瘤活性成分的提取工藝優(yōu)化及含量測定[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43(11)：906．

[10] 王笑民．論益氣活血法治療腫瘤[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，1998，5(10)：11-12．

[11] 劉婷，余克花，余燕影，等．豐城雞血藤H-103樹脂提純物抗MCF-7和A549的作用[J]．實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2008，26(1)：11-20．

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Comparative Efficacy before and after Purification of Total Flavonoids in Millettla Based on the Growth Inhibition of HepG2 and SMMC-7721 Hepatic Cell

Pan Hong，Wang Shuai，Meng Xiansheng，Bao Yongrui

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning 116600，China)

Objective:Discussion the pharmacodynamic efficacy before and after purification of total flavonoids in Millettla based on the growth inhibition of HepG2 and SMMC-7721 in liver tumors; Be clear the anti-hepatoma effect of Millettla basis material.Methods:s： Evaluation by Hepatoma cells' Inhibition rate,The total different doses of flavonoids in Millettla before and after purified was given to the two strains of HepG2 and SMMC-7721 hepatoma cells 24h、36h、48h. Detect inhibition of two strains of hepatoma cells by MTT assay. Results:Total flavonoids in Millettla before and after purified were able to inhibit HepG2 and SMMC-7721 cell proliferate significantly. At the same time within the administration,Millettla after purification of total flavonoids inhibit cancer rates greater than unpurified Millettla flavonoids inhibition.In addition,Whether before or after purification,Its anti-liver cancer effects enhanced with the increasing doses and time,Showed a significant time-effect and dose-effect relationship(P<0.05).Conclusion:By the comparison in vitro pharmacodynamic,After purification of total flavonoids Millettla display superior efficacy before purification efficacy,Show Millettla total flavonoids are the main material basis Millettla anti-liver cancer, Lay the foundation for Millettla development in the treatment of liver cancer and the clinical aspects of rational use.

Millettla Total Flavonoids；Hepatic Carcinoma；Efficacy Comparison；HepG2 Cells；SMMC-7721 Cells

2014-08-21

國家“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2013ZX09507005)

潘虹(1989-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向為藥物分析。

孟憲生 (1964-)，男，博士，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。

R285.5;R735.7

A

1673-2197(2015)01-0006-03

10.11954/ytctyy.201501004