周曉茂，薛偕華

(1．福建中醫(yī)藥大學(xué) 康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350003； 2．福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院 腦病科，福建 福州 350003)

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24-乙酰澤瀉醇A對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響

周曉茂1，薛偕華2*

(1．福建中醫(yī)藥大學(xué) 康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350003； 2．福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院 腦病科，福建 福州 350003)

目的：探討24-乙酰澤瀉醇A對(duì)氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響，闡明其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。方法：采用酶消化法培養(yǎng)大鼠VSMCs，在Ox-LDL(50mg/L)、24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)作用下，將所有大鼠分為空白對(duì)照組、Ox-LDL組和澤瀉A組三組，采用RT-PCR方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞MMP-9中mRNA的表達(dá)，采用Western blotting法檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，Ox-LDL刺激平滑肌細(xì)胞，MMP-9中mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞MMP-9中mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：24-乙酰澤瀉醇A可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞遷移，抑制其MMP-9表達(dá)，為動(dòng)脈粥樣硬化的臨床治療提供新方法。

24-乙酰澤瀉醇A；血管平滑肌細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，研究表明氧化損傷在AS及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[1]。氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成及血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[2]。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc,ECM )和基底膜的降解則是平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移的前提條件。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)是一個(gè)蛋白酶家族，由巨噬細(xì)胞、VSMCs等細(xì)胞產(chǎn)生，可廣泛降解ECM。其中，MMP-9為MMPs家族的重要成員，在VSMCs遷移至血管內(nèi)膜、新生內(nèi)膜形成、血管重構(gòu)及不穩(wěn)定性斑塊破裂等過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[3-4]。澤瀉為利水滲濕之要藥，24-乙酰澤瀉醇A為澤瀉中含有的主要萜類有效成分。研究表明，澤瀉中三萜類化合物具有利尿、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[5-6]。目前，24-乙酰澤瀉醇A抗As的作用機(jī)制尚不清楚，未見其對(duì)MMP-9表達(dá)影響的相關(guān)研究。本研究以O(shè)x-LDL誘導(dǎo)的大鼠VSMCs為模型，觀察24-乙酰澤瀉醇A對(duì)VSMCs遷移MMP-9表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；清潔級(jí)SD雄性大鼠4只，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(閩)2012-0001)；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL，1.32mg/L)(北京協(xié)生生物科技公司)；24-乙酰澤瀉醇A(上?？禈?biāo)有限公司)；RT-PCR試劑盒、Trizol(Promega公司)；MMP-9 PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；ECL試劑(北京碧云天有限公司)；山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗大鼠MMP-9、β-actin一抗(CST公司)；Western blot電泳設(shè)備(Bio-RAD公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Therom公司)；Leica DMIL LED倒置顯微鏡。

1.2 大鼠VSMCs分離及培養(yǎng)

雄性SD大鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離出胸主動(dòng)脈，刮去內(nèi)、外膜，將組織剪成1mm×1mm大小的組織塊,加入II型膠原酶，37℃下消化30min，加入濃度為20%的胎牛血清DMEM液，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)5～7天，細(xì)胞從組織塊周圍爬出并生長(zhǎng)融合、傳代，用濃度為10%的胎牛血清DMEM液培養(yǎng)，每隔2～3天換液1次，胰酶消化傳代。3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 細(xì)胞干預(yù)分組

取“1.2”項(xiàng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，換不含血清DMEM液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步于G0期。根據(jù)不同處理將細(xì)胞分為三組：(1)空白對(duì)照組：不加任何干預(yù)劑，24h后收集細(xì)胞；(2)Ox-LDL組：加Ox-LDL(50mg/L)，24h后收集細(xì)胞；(3)澤瀉A組：24-乙酰澤瀉醇A 10μg/mL預(yù)孵育1h，然后加Ox-LDL(50mg/L)刺激，24h后收集細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá)

用Trizol試劑(Gibco公司)提取總RNA，取1μg各組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再各取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進(jìn)行PCR。MMP-9的引物序列為：上游引物為5-CAAGGACGGTCGGTATTGGAAG-3，下游引物為5-AAACGAGTAACGCTCTGGGGAT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為348bp；內(nèi)參照GAPDH引物序列為：上游引物為5-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3，下游引物為5-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149bp。擴(kuò)增條件：95℃變性45s；54℃退火45s；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)，72℃延伸2min。取3μL產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳(100 V)18min，紫外燈下拍照，對(duì)電泳帶進(jìn)行吸光度掃描，以MMP-9/GAPDH代表MMP-9中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)MMP-9、p-ERK和ERK蛋白的表達(dá)

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后吹打離心，加100μL裂解緩沖液裂解，充分研磨后離心，吸取上清液，測(cè)樣品蛋白變性，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜取出用封閉液封閉2h，分別加入抗MMP-9、 β-actin(1∶1 000)抗體孵育，4℃下過夜，室溫下加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)60min。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，反應(yīng)1min后運(yùn)用Image-lab軟件進(jìn)行分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠VSMCs培養(yǎng)與鑒定

倒置相差顯微鏡下，單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形，有多個(gè)細(xì)胞突起，胞質(zhì)豐富，密度高，核圓形居中。生長(zhǎng)融合后呈典型“峰谷征”。見圖1。

圖1 原代大鼠VSMC細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：普通光鏡下細(xì)胞融合后呈“峰谷征”(×100)

2.2 24-乙酰澤瀉醇A對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

空白對(duì)照組VSMCs存在著MMP-9 mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)；加入Ox-LDL(50mg/L)處理24h后，MMP-9 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0．05)。24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)預(yù)孵育VSMCs1h，Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MMP-9 mRNA表達(dá)上調(diào)可部分抑制(P<0．05)。GAPDH作為內(nèi)參。見圖2。

圖2 平滑肌細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與Ox-LDL組比較，#P<0.05。

2.3 24-乙酰澤瀉醇A對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，Ox-LDL(50mg/L)刺激下VSMCs的MMP-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)預(yù)孵育VSMCs 1h亦可明顯抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs MMP-9的蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0．01)。β-actin作為內(nèi)參。見圖3。

圖3 平滑肌細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0．05；與Ox-LDL組比較，##P<0．05。

3 討論

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientalis(Sam．)Juzep．)的干燥塊莖，具有利水滲濕、化濁降脂功能。澤瀉中含有的主要三萜類成分為澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B及23-乙酰化物等。從澤瀉脂溶性部分中分離得到的三萜類化合物被認(rèn)為是降血脂的有效成分，其中以24-乙酰澤瀉醇A作用最強(qiáng)[7]。以往研究主要集中于24-乙酰澤瀉醇A的降脂作用,而關(guān)于抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移方面的研究較少。

平滑肌細(xì)胞(VSMC)位于血管中膜，是血管中層唯一的細(xì)胞成分。生理?xiàng)l件下，VSMC通過收縮和舒張調(diào)節(jié)血管張力，通過分泌和釋放血管調(diào)節(jié)因子維持血管正常功能。VSMC由中膜遷移到內(nèi)膜下間隙并異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等疾病的共同細(xì)胞病理基礎(chǔ)。而細(xì)胞外基質(zhì)尤其是基底膜為VSMCs遷移必須克服的生理屏障，基質(zhì)金屬蛋白酶是降解VSMCs基底膜基質(zhì)的主要酶類。MMPs可降解ECM，其中MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)是降解基底膜Ⅳ型膠原最主要的MMPs[8]。曹冠群等[9]研究表明：鋅指蛋白A20通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)，抑制Ox-LDL介導(dǎo)VSMCs的遷移作用。研究表明干擾MMP-9基因表達(dá)，能有效抑制VSMCs的遷移[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Ox-LDL組的MMP-9表達(dá)水平較空白對(duì)照組有所升高，而澤瀉醇A(10μg/mL)組MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平較Ox-LDL組降低，且MMP-9 蛋白表達(dá)水平下降較mRNA顯著，可能由于MMP-9為分泌型蛋白，除檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的MMP-9蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)基中還有分泌型MMP-9蛋白，表明MMP-9表達(dá)的增高可能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞遷移；24-乙酰澤瀉醇A可抑制VSMCs遷移，其作用可能與抑制MMP-9的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，24-乙酰澤瀉醇A可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠平滑肌細(xì)胞遷移，抑制其MMP-9表達(dá)，為24-乙酰澤瀉醇A防治動(dòng)脈粥樣硬化提供重要的理論和實(shí)踐依據(jù)。

[1] BEDINER JA,HEINECKE JW.The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis[J].Free Radic Bio Med,1996,20(5)：707-727.

[2] JUN LIU, YINGANG REN,LI KANG,et al.Oxidized low-density lipoprotein increases the proliferation and migration of human coronary artery smooth muscle cells through the upregulation of osteopontin[J].Int J Mol Med , 2014 ,33(5)：1341-1347.

[3] 易善清，胡蘇華，謝明，等.桃紅四物湯含藥血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移β3整合素及基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響[J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(6)：714-718．

[4] 李科，劉俊明．基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-9與冠心病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2011，19(2)：108-111．

[5] 吳水生．澤瀉的藥學(xué)與臨床研究[M]．北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2009：161．

[6] 吳水生，郭改革，施紅，等．澤瀉提取物Alisol Monoacetate A和B對(duì)HepG2細(xì)胞株膽固醇代謝的影響[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(7)：475．

[7] 黃珍,劉詠松.澤瀉湯降血脂藥理作用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,9(5)：55-56.

[8] FERRETTIG, BACCHETTIT, MARETTI E, et al. Effect of homocysteinylation on human high-density lipoproteins: a correlation with paraoxonase activity[J]. Metabolism, 2003, 52(2)：146-1511.

[9] 曹冠群，趙先英，張定林,等.鋅指蛋白A20抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2012,29(2)：173-175.

[10] TURNER NA, HALL KT, BALL SG, et al. Selective gene silencing of either MMP-2 or MMP-9 inhibits invasion of human saphenous vein smooth muscle cells[J]. Atherosclerosis,2007,193(1)：36-43.

[11] SUH SJ, JIN UH, CHOI HJ, et al. Cryptotanshinone from Salvia miltiorrhiza Bunge has an inhibitory effect on TNF-induced matrix metalloproteinase-9 production and HASMC migration via down-regulated NF-κB and AP-1[J]. Biochem Pharmacol, 2006, 72(12): 1680-9.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-11-21

福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(WZSY201304)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013-ZQN-20-28)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473744)

周曉茂(1988-)，女，福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)槟X血管病的基礎(chǔ)和康復(fù)研究。

薛偕華(1978-)，男，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail：465356738@qq.com

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0007-03

10.11954/ytctyy.201504005