摘 要：將鴿Ⅰ型副粘病毒F基因亞克隆到pGEX-4T-1載體中，并用大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)。以純化的F蛋白為診斷抗原，建立鴿Ⅰ型副粘病毒間接ELISA檢測(cè)方法，用方陣法確定了間接ELISA檢測(cè)的最佳條件：抗原1∶128稀釋即抗原包被量為0.6 μg/孔，血清1∶400稀釋，與一抗的最佳作用時(shí)間為60 min，與酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間為60 min，底物顯色的最佳作用時(shí)間為15 min。用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的35份陽(yáng)性血清和12份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性符合率達(dá)到97 %以上，陰性符號(hào)率達(dá)100 %。

關(guān)鍵詞：鴿Ⅰ型副粘病毒；F基因；原核表達(dá)；ELISA；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2015）06-0059-03

鴿Ⅰ型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1）病又稱鴿瘟或鴿新城疫，是一種由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus 1，PMV-Ⅰ）引起的一種急性、熱性、高度性傳染病。鴿Ⅰ型副粘病毒的基因組為一條單股負(fù)鏈RNA，長(zhǎng)約15 kb，包括6個(gè)基因：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，其中F基因全長(zhǎng)為1 662 bp。編碼553個(gè)氨基酸。融合糖蛋白（F蛋白）主要負(fù)責(zé)病毒與易感細(xì)胞發(fā)生融合、進(jìn)入細(xì)胞和產(chǎn)生溶血，并對(duì)新城疫病毒的毒力起主要決定作用，因此對(duì)鴿新城疫F蛋白的研究具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)選取F基因部分序列在原核大腸桿菌中高效表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以純化的F蛋白作為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性進(jìn)行初步檢測(cè)，為鴿新城疫F蛋白單克隆抗體的研制奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步建立高效準(zhǔn)確鴿新城疫的診斷方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

含鴿Ⅰ型副粘病毒F基因的大腸桿菌BL21（DE3）重組菌株P(guān)GEX4T-1-PPMV-1-F，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

IPTG、丙烯酰胺、雙甲基丙烯酰胺和十二烷基磺酸鈉購(gòu)自Promega公司，酵母提取物、胰蛋白胨、中等分子量蛋白Marker、氨芐青霉素、Tris-Cl、DTT、考馬斯亮蘭、PEG4000等購(gòu)自上海生工公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 血清

鴿Ⅰ型副粘病毒陽(yáng)性血清35份，鴿Ⅰ型副粘病毒陽(yáng)性血清12份均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確于-70 ℃保存的重組菌株P(guān)GEX4T-1-PPMV-1-F（924），劃線接種于LB瓊脂平板（Amp+）上，倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h～16 h；然后挑取單個(gè)菌落接種于4 mL的LB培養(yǎng)液中（Amp+），37 ℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在將此菌以1 %的接種量接種于100 mL LB培養(yǎng)液（Amp+）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1 %接種量接種于1 000 mL含LB培養(yǎng)液（Amp+）中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，之后收集菌體。用PBS（pH=7.4）懸浮菌體沉淀，加入1/100體積的溶菌酶10 μg/mL，室溫作用15 min。反復(fù)凍融3～4次后，在冰浴中超聲裂解至菌液澄清透亮；超聲條件為：功率18 W，超聲作用8 s，停6 s，連續(xù)超聲30 min左右，使菌體全部破碎；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用8 M尿素溶解，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 包涵體蛋白的提取

將誘導(dǎo)的菌體8 000 rpm/min離心5 min，Buffer A溶液洗滌1次，用Buffer A重懸沉淀后強(qiáng)超聲波破碎2 min～3 min，至溶液為半透明。4 ℃ 10 000 rpm/min離心10 min，棄上清。用少許Buffer A輕輕洗滌沉淀。加入原細(xì)菌培養(yǎng)液體積1/10的Bueffr A溶液重懸沉淀，加入SKL（N-十二烷基肌氨酸鈉）室溫靜置2 h，使其沉淀緩慢溶解。4 ℃ 10 000 rpm/min離心10 min，棄沉淀，取上清，分別加入PEG 4000至2 %（w/v）、氧化型谷胱甘肽至l mM、還原型谷胱甘肽至2 mM，靜置30 min 2 h，轉(zhuǎn)至處理好的透析袋中，于0.01 M TE溶液（pH8.0）中透析2 d～3 d，取出用紫外風(fēng)光光度計(jì)測(cè)OD260和OD280，計(jì)算蛋白濃度。提取蛋白立即使用或分裝，-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋度的確定

取純化的重組鴿新城疫F蛋白用包被稀釋液做1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀釋；陰性、陽(yáng)性血清用封閉液分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋后，用方陣法確定抗原及對(duì)照血清的最適工作濃度。

1.5.2 間接ELISA各工作條件的摸索

確定抗原與待檢血清作用時(shí)間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應(yīng)板，封閉，抗原與待檢血清作用時(shí)間分別為40 min、 60 min、80 min，其它條件相同，計(jì)算P/N值，確定抗原與待檢血清最佳作用時(shí)間。

確定待檢血清與酶標(biāo)二抗作用時(shí)間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應(yīng)板，封閉，待檢血清與酶標(biāo)二抗作用時(shí)間分別為 40 min、60 min、80 min，其它條件相同，計(jì)算P/N值，確定待檢血清與酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間。

確定底物顯色液最佳作用時(shí)間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應(yīng)板，其它條件相同，加入OPD-H2O2底物顯色液，每孔加100 μL，室溫避光顯色10 min、15 min、20 min時(shí)分別用 2 mol/L H2SO4每孔50 μL終止反應(yīng)，計(jì)算P/N值，確定底物顯色液最佳作用時(shí)間。

1.6 臨床樣本的檢測(cè)

應(yīng)用建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的35份鴿Ⅰ型副粘病毒陽(yáng)性血清和12份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，確定其特異性和敏感性。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的表達(dá)與純化

對(duì)F蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲處理后，取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)于沉淀中，融合蛋白大小約為60 kD，而上清中則無(wú)目的條帶出現(xiàn)，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在，結(jié)果如見(jiàn)圖1所示。

2.2 純化蛋白的濃度

以0.01 M TE溶液做空白對(duì)照，將純化的重組蛋白用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，結(jié)果如下：

OD280=0.786

OD260=0.497

帶入公式樣本蛋白質(zhì)含量（mg/mL）= （1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)

計(jì)算得蛋白濃度為：0.772 mg/mL

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 最佳抗原及抗體工作濃度的確定

用純化的重組鴿新城疫F蛋白包被ELISA平板，采用方陣法確定蛋白的最佳包被濃度及陽(yáng)性血清的最佳稀釋倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)下表1。

從上表的F-ELISA方陣滴定結(jié)果表明，出 OD492 nm值為0.978時(shí)，P/N最大，此時(shí)F蛋白及陽(yáng)性血清的稀釋度為最佳工作條件，抗原最佳包被濃度為1∶128，即0.6 μg/孔 的抗原包被量。血清最佳稀釋度為1∶400。

2.3.2 一抗作用時(shí)間的確定

測(cè)出抗原與陽(yáng)性血清及陰性血清在不同時(shí)間作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作濃度），取平均值，計(jì)算P/N，結(jié)果見(jiàn)表2，當(dāng)陰陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為60 min時(shí)，P/N值最大，故選擇與一抗作用時(shí)間為60 min。

2.3.3 二抗作用時(shí)間的確定

測(cè)出陽(yáng)性血清及陰性血清與二抗在不同時(shí)間作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作），取平均值，計(jì)算P/N，結(jié)果見(jiàn)表3，當(dāng)陰、陽(yáng)性血清與酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為60 min時(shí)，P/N值最大，故選擇與二抗作用時(shí)間為60 min。

2.3.4 底物顯色液作用時(shí)間的確定

抗原、血清均采用最佳工作濃度，其它條件相同，測(cè)出陽(yáng)性血清、陰性血清與底物顯色液不同作用時(shí)間的OD492 nm值，取平均值，計(jì)算 P/N，結(jié)果見(jiàn)表4，當(dāng)?shù)孜镆簳r(shí)間為15 min時(shí)， P/N值最大，且陽(yáng)性O(shè)D492 nm>0.2，故選擇底物液作用時(shí)間為15 min。

2.4 臨床樣本的檢測(cè)

應(yīng)用建立的間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的35份陽(yáng)性血清和12陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果35份陽(yáng)性血清應(yīng)盡量的ELISA方法檢測(cè)出陽(yáng)性34份，準(zhǔn)確率達(dá)到97.14 %，對(duì)12份陰性血清用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，表明建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有較好的特異性和敏感性。

3 討論與結(jié)論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法自建立至今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)病的診斷以及在腫瘤學(xué)、免疫病理學(xué)等方面已廣泛應(yīng)用，該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。ELISA是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物的高效催化性結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的檢測(cè)方法。間接ELISA是將已知的定量抗原吸附在反應(yīng)板上，加入待測(cè)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去雜蛋白后加入酶標(biāo)記的二抗，洗滌除去未吸附或多余的二抗，加入底物顯色，以顯色反應(yīng)推知抗體量。該方法可以非常靈敏地檢測(cè)血清中的IgG抗體。

本實(shí)驗(yàn)選用了PGEX-4T-1融合表達(dá)載體后，用PITG誘導(dǎo)，SDS-APGE凝膠電泳分析顯示，F(xiàn)蛋白為60 KDa左右，誘導(dǎo)產(chǎn)物在預(yù)計(jì)大小處有表達(dá)蛋白產(chǎn)生，是F蛋白片段34 KDa，再加上PGEX-4T-1載體自帶的26 Kda的GST標(biāo)簽，所以F蛋白片段在PGEX-4T-1/BL21（DE3）中得到了穩(wěn)定的表達(dá)，通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物處理后進(jìn)行SDS-APGE電泳后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的蛋白都位于包涵體中。

把表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化作為包被抗原，建立間接ELISA檢測(cè)方法，用方陣法確定其最佳反應(yīng)條件：抗原1∶128稀釋即抗原包被量為0.6 μg/孔，血清1∶400稀釋，與一抗的最佳作用時(shí)間為60 min，與酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間為60 min，底物顯色的最佳作用時(shí)間為15 min。并把建立的方法進(jìn)行了臨床樣本的檢測(cè)，具有較好的特異性和敏感性，為鴿新城疫的診斷、防治制劑的研制奠定了基礎(chǔ)?！酢?/p>