王瑩　汪航　曾日中　黃茂芳　桂紅星

摘 要 采用海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋劑，選取交聯(lián)時間、海藻酸鈉和聚乙烯醇用量比（SA ∶ PVA）以及海藻酸鈉和聚乙烯醇的總濃度為影響因素設計L49（52×7）正交實驗，探討包埋的最佳理化條件。以包埋材料的成球效果，包埋小球的硬度、彈性及微觀結構為考察指標，比較包埋小球性能，探討包埋條件。結果發(fā)現(xiàn)當SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時間為24 h時包埋效果最佳。

關鍵詞 包埋固定化；海藻酸鈉；聚乙烯醇；正交實驗

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A

Optimization of Producting Immobilized Ball by

Sodium Alginate and Polyvinyl Alcohol

WANG Ying1， WANG Hang3， ZENG Rizhong2， HUANG Maofang1， GUI Hongxing1 *

1 Agricultural Product Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Zhanjiang， Guangdong 524001， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

3 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract Sodium alginate（SA）-polyvinyl alcohol（PVA）is often used for the immobilization of microorganisms which are used in wastewater treatment system. But previous research often chose treatment efficiency as the main indicator of immobilized condition selection. This study attempts to explore the immobilized condition from the characteristics of immobilized materials. Research by sodium alginate and polyvinyl alcohol as immobilized materials， an orthogonal experiment by three factors with 52×7 levels L49（52×7）was designed to explore the best immobilized condition. The four factors were crosslinking time， the ratio of sodium alginate and PVA（SA ∶ PVA）and the total concentration of sodium alginate and polyvinyl alcohol. Based on the balling effect， hardness and microstructure of the immobilized ball， the results showed that the optimized condition of immobilized was SA ∶ PVA ratio of 7 ∶ 3， the total concentration of 4%， the cross-linking time 24 h.

Key words Immobilize； Sodium alginate； Polyvinyl alcohol； Orthogonal experiment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.024

包埋法固定化是一種將菌體包埋于各種多孔載體中，使菌體固定化的方法。微生物包埋固定后，可以有效防止微生物流失，增加其局部濃度，以實現(xiàn)反應器快速啟動并提高活性和耐沖擊性[1]。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、明膠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。有研究結果表明，瓊脂強度較差，聚丙烯酰胺凝膠對生物有毒性，明膠內部結構密實，傳質性能差[2]。在眾多固定化材料中，國內外研究者針對海藻酸鈉（SA）和聚乙烯醇（PVA）作為復合包埋材料處理廢水的研究應用最為廣泛[3]，使用這2種材料混合制作載體，克服了材料各自的缺點，制成的載體材料形狀規(guī)則，不出現(xiàn)粘連現(xiàn)象[4-5]。SA和PVA復合化學交聯(lián)后形成互穿網(wǎng)絡水凝膠結構，可以保證較高的機械強度[6]。魏大鵬等[7]利用SA-PVA復合材料包埋混合菌劑制成的固定化小球處理養(yǎng)殖廢水，24 h氨氮及亞硝態(tài)氮的去除率達到96%及98%。馬挺等[8]利用SA-PVA共固定化細胞脫除燃料油中的有機硫，總脫硫率達到87.64%，固定化細胞可重復使用5次，使用時間最多可達到250 h以上。大部分研究者集中研究去除效果來優(yōu)化包埋固定化的條件[7，9-10]，而利用包埋小球本身機械性能作為優(yōu)化指標的系統(tǒng)研究尚未見報道。本研究選取SA和PVA作為制備包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液作交聯(lián)劑，研究交聯(lián)時間、SA和PVA用量比以及SA和PVA的總濃度對包埋小球性能的影響，從中找尋規(guī)律，為包埋固定化條件的優(yōu)選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

包埋劑：SA國產(chǎn)化學純，PVA為進口分裝分析純；交聯(lián)劑：CaCl2，H3BO3，NaCO3均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 包埋小球的制備 以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為制備包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液（NaCO3調節(jié)pH至6.7）作交聯(lián)劑，機械攪拌混合均勻后，自然滴落成型。

1.2.2 包埋固定化條件優(yōu)選 選擇交聯(lián)時間、海藻酸鈉和聚乙烯醇用量比以及海藻酸鈉和聚乙烯醇的總濃度為三因素，設計表1中的L49（52×7）正交實驗，對固定化包埋材料的制備參數(shù)進行優(yōu)化。

1.2.3 包埋小球硬度彈性測定 利用Brookfield公司CT3質構儀對固定化材料進行穿刺實驗，測定固定化小球的硬度、彈性，夾具底座TA-BT-KIT，探頭TA-9型，觸發(fā)點負載0.07N，測試速度和返回速度均為0.5 mm/s，循環(huán)2次，每次刺入深度為3 mm，每種材料測試5個平行樣的平均值作為其硬度、彈性。

1.2.4 包埋小球微觀結構觀察 依次用濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇，丙酮和乙酸異戊酯，對制備的固定化小球進行溶劑置換，風干。液氮脆斷后，選擇完整的斷面進行噴鉑處理，采用日本日立公司生產(chǎn)的S-4800型掃描電子顯微鏡觀察固定化小球的內部微觀結構。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對正交實驗所得數(shù)據(jù)利用SPSS13.0進行Kruskal-Wallis秩和檢驗及主體間效應的檢驗[11]。

2 結果與分析

2.1 包埋固定化條件優(yōu)選

正交實驗所得結果見表2。具有代表性的成球效果見圖1。

因為制作小球初始階段考察成球效果，所以不考慮交聯(lián)時間對成球效果的影響，成球效果見表2所示編秩。分別考察因素B及因素C對成球效果是否有影響。結果見表3、4所示。成球效果的數(shù)值越大代表成球的效果越好，即Mean Rank（MR）值越大代表該水平的成球效果越好。表3-a中MR6>MR5>MR4>MR7>MR3>MR2>MR1，表明SA：PVA值（B）越大成球效果越好，但是單一SA材料的成球效果還是不如混合材料，成球效果最好的SA ： PVA為9 ： 1。表3-b中P為0.009<0.05，表明不同SA ： PVA水平的成球效果有顯著性差異。同樣從表4中可以看出，不同SA+PVA總濃度（C）對成球效果有差異（p=0.02<0.05），隨著SA+PVA總濃度的上升，成球效果呈現(xiàn)一種先變好再變差的趨勢。實驗結果顯示，當SA+PVA總濃度為0.6%時成球效果最佳。從成球性能來說最佳水平為B6C3，A無影響。

用SPSS13.0軟件對硬度和彈性測試結果進行主體間效應的檢驗，結果見表5。結果顯示不同交聯(lián)時間組對比，硬度和彈性無顯著性差異（p硬度=0.197，p彈性=0.505，都大于0.05），交聯(lián)時間對包埋小球的硬度和彈性沒有影響。其他2個因素不同水平組之間硬性和彈性具有顯著性差異，p均小于0.05。對正交實驗所得硬度值進行極差分析，A，B，C 3因素的R′值分別為0.99，3.32，4.28，R′C> R′B> R′A，所以SA+PVA總濃度（C）對小球硬度的影響最為重要，影響程度的順序為SA+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時間（A），最佳理化條件為A5B7C5。推斷增加材料總濃度、交聯(lián)時間都能增加包埋小球的硬度，在2種材料中，海藻酸鈉對硬度影響更加明顯；對所得彈性值進行極差分析，A，B，C 3因素的R′值分別為0.62，1.47，1.93，R′C> R′B>R′A，SA+PVA總濃度對小球彈性的影響最為重要，影響程度為SA+PVA總濃度>SA ∶ PVA值>交聯(lián)時間（A），最佳理化條件A3B5C5。

2.2 微觀結構分析

根據(jù)成球效果與硬度彈性的分析結果選擇A1B4C3，A5B5C3，A4B6C3及A2B5C2的電鏡圖片進行比較，電鏡結果有3種都能形成較好的網(wǎng)絡圈套結構，這種結構具有較好的穩(wěn)定性。同時發(fā)現(xiàn)相同SA+PVA總濃度（C）的情況下，SA ∶ PVA值（B）較低時，PVA含量較大（A1B4C3），如圖2-a所示，小球結構緊密，但是孔隙率低不利于物質的內外傳遞，可能會對廢水處理效率有影響。當SA ∶ PVA值高時，SA含量較大（A4B6C3），如圖2-b所示小球結構松散，強度低，容易破碎，固定化的細菌大部分滲漏使用壽命短。在相同SA ∶ PVA值的情況下，SA+PVA總濃度?。ˋ2B5C2），如圖2-d所示，小球的孔隙率大，有較大的比表面積供細菌附著，有利于內外物質傳遞，且更為經(jīng)濟。所以綜合考慮成球效果，包埋小球硬度及彈性，微觀結構，實驗操作方便（時間選擇）。選擇的最佳包埋固定化條件為A3B5C2，也就是SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時間為24 h。

3 討論與結論

SA+PVA總濃度相同時，SA ∶ PVA值（B）越大成球效果越好，但是單一SA材料的成球效果不如混合材料。孫麗慧等[12]發(fā)現(xiàn)當SA濃度高，PVA濃度低時，固定化細胞容易成球。隨著SA量的增加固定化小球的孔隙率增大，強度也有所增加，但是彈性差，易破碎[13]。PVA濃度太低時固定化小球的機械穩(wěn)定性較差，而且固定化小球使用后表面易出現(xiàn)破裂和小孔，固定化小球機械強度的損耗很大程度上是由于海藻酸鈣受到腐蝕溶解導致的[14]。為實現(xiàn)固定化小球的重復利用，保持較好的機械穩(wěn)定性，需要綜合考慮其他性能決定最佳配比。

不同總濃度（C）對成球效果有差異（p=0.02<0.05），隨著SA+PVA總濃度的上升，成球效果呈現(xiàn)一種先變好再變差的趨勢，當SA+PVA總濃度為6%時成球效果最佳。SA+PVA總濃度（C）對小球硬度彈性的影響最為重要，影響程度的順序均為SA+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時間（A）。最佳理化條件分別為A5B7C5、A3B5C5。在SA+PVA總濃度較低的情況下，形成的小球結構松散，表面張力不夠，表現(xiàn)出不規(guī)則形狀，而且在攪拌過程中，容易被機械攪拌器破壞；當SA+PVA總濃度適中時，在機械攪拌下易被分散，交聯(lián)劑加入后，能快速與SA+PVA發(fā)生交聯(lián)反應，使乳滴固化保持現(xiàn)有球形；在SA+PVA總濃度太高，溶液粘度超過一定限度，相同制作條件乳滴趨向更大，與滴嘴的接觸面也加大，不易滴落，容易拖尾，交聯(lián)劑加入后不能及時發(fā)生交聯(lián)反應使微球固化，在攪拌過程中，容易被機械攪拌器破壞形成破損的半球[15]。

小球的硬度與彈性結果顯示交聯(lián)時間對包埋小球機械性能的影響沒有顯著性差異，賴子尼等[16]同樣采用質構儀對海藻酸鈉-聚乙烯醇進行硬度的分析，得到交聯(lián)時間能夠較大程度改變凝膠硬度的結果。與本文結果有較大出入，推測原因可能是，賴子尼等人選擇交聯(lián)時間為15～45 min，而本文選擇時間為12～36 h，在交聯(lián)發(fā)生的初始階段混合材料與交聯(lián)劑的反應時間對材料的硬度有較大影響，而后逐漸減弱，當交聯(lián)時間達到12 h時，包埋材料已經(jīng)完全交聯(lián)，再增加交聯(lián)時間不會影響包埋小球彈性和硬度，不需要作為主要考慮對象。三因素對小球機械性能影響程度的順序為SA+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時間（A）。最佳理化條件分別為A5B7C5，A3B5C5。隨著SA ∶ PVA值的增大彈性呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這也與廖強等[13]所得的結果比較相符，廉哲等[17]也發(fā)現(xiàn)隨SA含量增加，SA+PVA水凝膠拉伸強度和斷裂伸長率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且在SA ∶ PVA值為7 ∶ 3時達最大值。

綜合考慮成球效果，包埋小球硬度及彈性，微觀結構，實驗操作方便（時間選擇）。選擇的最佳包埋固定化條件為A3B5C2，也就是SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時間為24 h。本研究主要以制作完成的包埋小球力學性能及微觀結構來探討包埋條件，為固定化小球的實際使用提供一定的理論基礎。對今后力學性能及微觀結構的變化還有待進一步研究。

致 謝 楊春亮研究員、余和平研究員和課題組其他成員在實驗過程給予的指導或幫助，在此表示感謝！

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