常誠(chéng)　姜玲　阮穎

摘要擬南芥SDG8通過(guò)調(diào)控開(kāi)花關(guān)鍵基因FLC位點(diǎn)上H3K36 的甲基化水平促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)而抑制植株早花。甘藍(lán)BolSDG8是擬南芥SDG8的同源基因，經(jīng)比對(duì)，選擇一段約為359 bp的保守序列，命名為BolSDG8RNAi，通過(guò)構(gòu)建RNA干擾載體，并將其轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥（Col0）中，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因植物的表型觀察，開(kāi)花天數(shù)及蓮座葉數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)BolSDG8 RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出與擬南芥sdg82突變體相似的生物學(xué)表型，即植株弱小，明顯早花，暗示BolSDG8與擬南芥SDG8在調(diào)控植物開(kāi)花上具有相似的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步深入研究甘藍(lán)BolSDG8的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞BolSDG8；RNA干擾；擬南芥；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-036-03

RNA Interference Vector Construction of BolSDG8 and Genetic Transformation of Arabidopsis thaliana

CHANG Cheng， JIANG Ling， RUAN Ying

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

AbstractArabidopsis SDG8 specifically regulates methylation of H3K36 on the flowering key gene FLC， to promote its transcriptional expression and inhibit early flowering in plants. BolSDG8 of Brassica oleracea is a homologous gene of SDG8 of Arabidopsis thaliana. By blasting， a conserved sequence of 359 bp named BolSDG8RNAi was selected via construction of RNA interference vector and genetic transformation into wildtype Arabidopsis plants （Col0）， and obtained one transgenic plant with stable inheritance. Through phenotype observation of transgenic plants in T3， and analysis of days to bolting and rosette leaves number， it was found that BolSDG8 RNAi transgenic plants in Arabidopsis showed similar biological phenotypes to sdg82 mutants， weak and significantly early flowering， laying a foundation for further study of biological function of BolSDG8.

Key wordsBolSDG8； RNA interference； Arabidopsis thaliana； Genetic transformation

開(kāi)花是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，植物的花期對(duì)于植物維持正常的生命周期具有重要意義。研究表明，植物開(kāi)花至少受到5條主要途徑調(diào)控：光周期途徑、春化作用途徑、GA途徑、自主途徑和表觀遺傳調(diào)控途徑。組蛋白甲基化修飾作為重要的表觀遺傳調(diào)控方式，積極參與到植物開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。擬南芥SDG8（SET DOMAIN GROUP 8）編碼的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是酵母SET2的同源物[1-2]，包含約1 806個(gè)氨基酸序列，其中含一個(gè)CW（cysteine and tryptophan conserved）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)AWS（Associated With SET）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Post SET結(jié)構(gòu)域[3]，能特異性地催化組蛋白H3第36位賴氨酸（H3K36）發(fā)生雙、三甲基化修飾。功能缺失的擬南芥sdg8突變體，其植株表現(xiàn)為弱小、早花，而究其早花原因，是由于其H3K36的雙、三甲基化水平顯著降低，開(kāi)花關(guān)鍵基因FLC轉(zhuǎn)錄受到抑制，進(jìn)而使植株表現(xiàn)為早花。因此，擬南芥SDG8介導(dǎo)的H3K36甲基化在抑制植物早花過(guò)程中起著重要作用。

甘藍(lán)BolSDG8是擬南芥SDG8的同源基因。生物信息學(xué)分析表明，BolSDG8全長(zhǎng)cDNA為5 088 bp，編碼1 696個(gè)氨基酸，與擬南芥SDG8氨基酸序列的同源性達(dá)到87%，也包含一個(gè)CW結(jié)構(gòu)域、一個(gè)AWS結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Post SET結(jié)構(gòu)域。因此，筆者通過(guò)構(gòu)建BolSDG8 RNA干擾載體和浸花法轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥（Col0），檢測(cè)來(lái)自甘藍(lán)BolSDG8基因的片段能否有效沉默擬南芥SDG8的功能[4]，進(jìn)而研究甘藍(lán)BolSDG8與擬南芥SDG8在調(diào)控植物開(kāi)花上是否具有相似的生物學(xué)功能，為深入研究BolSDG8的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為培育適當(dāng)早花早熟的甘藍(lán)型油菜品種[5]提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料

擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col0和突變體sdg82；大腸桿菌（E.coli）DH5α；根癌農(nóng)桿菌GV3101；載體pMD19 T vector和pFGC5941，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1甘藍(lán)BolSDG8RNAi的克隆。

通過(guò)比對(duì)擬南芥SDG8與甘藍(lán)BolSDG8cDNA序列，選擇一段約359 bp的保守序列，命名為BolSDG8RNAi，設(shè)計(jì)引物序列：

BolSDG8RNAi F：

5′GGCGCGCC GGATCC AAGATTCCTTCCCCACTTTCGTCAT3′（AscI/BamHI）

BolSDG8RNAi R，

5′ CCATGG TCTAGATTCATGACACTGAATGGGAATGAGG3′（NcoI/XbaI）。

采用高保真酶PCR擴(kuò)增后，獲得目的片段。對(duì)其回收并連接至pMDl9T載體，命名為pMDl9TBolSDG8RNAi，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑選陽(yáng)性單菌落送至公司測(cè)序。

1.2.2RNAi干擾載體的構(gòu)建。

首先使用BamH I和Xba I雙酶切載體pMDl9TBolSDG8RNAi和pFGC5941（圖1），將BolSDG8RNAi反向插至查爾酮內(nèi)含子與終止子之間，獲得載體pBolSDG8RNAi；然后使用Asc I和Nco I雙酶切載體pMDl9TBolSDG8l和pBolSDG8RNAi，將目的片段正向插至35 S啟動(dòng)子與查爾酮內(nèi)含子之間，獲得干擾載體pFGC5941BolSDG8RNAi。

1.2.3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。

將pFGC5941BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中，挑選陽(yáng)性克隆用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。

采用浸花法[3]將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)至野生型擬南芥（Col0），采用濃

注：a.片段克?。籦.pFGC5941BolSDG8RNAi干擾載體。

圖1RNA干擾載體構(gòu)建

度30 mg/ml PPT噴施擬南芥幼苗進(jìn)行篩選，對(duì)獲得的抗性苗使用如下引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，確認(rèn)是否為轉(zhuǎn)基因植株。

35S825 F：5′ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT3′；

Intron825 R：5′TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC3′。

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察與生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。

對(duì)生長(zhǎng)于長(zhǎng)日照條件下（16h/8h）的野生型擬南芥Col0、突變體sdg82和轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行開(kāi)花天數(shù)和抽薹時(shí)蓮座葉數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1BolSDG8RNAi的克隆

通過(guò)比對(duì)，選擇一段359 bp

的保守序列作為RNAi干擾片段（圖2），克隆到BolSDG8RNAi目的片段，并將其連接至pMDl9T載體上，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中，挑選陽(yáng)性單菌落送至公司測(cè)序，經(jīng)比對(duì)，目的片段與預(yù)期片段大小完全一致（圖3）。

注：M.Marker；1.BolSDG8RNAi PCR擴(kuò)增；+.陽(yáng)性對(duì)照；—.陰性對(duì)照。

圖2BolSDG8RNAi基因PCR電泳圖譜

圖3BolSDG8RNAi序列對(duì)比

2.2BolSDG8干擾載體構(gòu)建

根據(jù)圖1所示，將BolSDG8RNAi正反插至pFGC5941載體上，經(jīng)酶切驗(yàn)證，BolSDG8干擾載體pFGC5941BolSDG8RNAi構(gòu)建成功，酶切后的片段大小與預(yù)期相符（圖4）。

2.3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)浸花法和PPT抗性篩選[6]，獲得抗性苗（圖5）。通過(guò)改良的CTAB法提取抗性苗總DNA，并進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果顯示，抗性苗為轉(zhuǎn)基因植株（圖6）。轉(zhuǎn)化共計(jì)42株，分株收取種子。經(jīng)檢測(cè)共計(jì)3株完成轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化苗命名為BolSDG8RNAi。

2.4BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型

在長(zhǎng)日照條件下，觀察生長(zhǎng)35 d的T3代BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，與Col0相比，BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)弱小，明顯早花，其

整體生物學(xué)表型與sdg82突變體相似（圖7）。由圖8可知，

注：M.Marker；1.未酶切質(zhì)粒；2.Asc I +Nco I雙酶切；3.BamH I單酶切；4.Xba I單酶切。

圖4pFGC5941BolSDG8RNAi的質(zhì)粒酶切

圖5BolSDG8RNAi抗性平板篩選

注：M.Marker；1～3.BolSDG8RNAi抗性苗；+.陽(yáng)性對(duì)照；—.陰性對(duì)照。

圖6BolSDG8RNAi抗性苗PCR檢測(cè)電泳圖譜

無(wú)論是蓮座葉數(shù)目還是開(kāi)花天數(shù)，BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株明顯少于Col0，接近于sdg82，這進(jìn)一步證實(shí)了BolSDG8RNAi轉(zhuǎn)基因植株具有與擬南芥sdg82突變體相似的早花表型。

3討論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記[7]，也是參與開(kāi)花調(diào)控的重要途徑之一[8]。其主要通過(guò)改

圖7生長(zhǎng)35 d的sdg82、BolSDG8RNAi和Col0

圖8擬南芥蓮座葉數(shù)目和開(kāi)花天數(shù)

變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了重要作用[9]。組蛋白賴氨酸甲基化修飾是通過(guò)特異的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化實(shí)現(xiàn)的[10]。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histonelysine methyltransferase，HLMT）是一類含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白[11]，進(jìn)化上保守的SET結(jié)構(gòu)域包含約130個(gè)氨基酸序列，形成一個(gè)結(jié)狀結(jié)構(gòu)的酶催化中心。AtSDG8是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能特異性地催化組蛋白H3K36發(fā)生雙、三甲基化，導(dǎo)致開(kāi)花關(guān)鍵基因FLC表達(dá)水平下降，從而使植物早花[12]。

AtSDG8以130多個(gè)堿基對(duì)形成一個(gè)節(jié)狀的酶催化中心[13]，即組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶通過(guò)催化組蛋白的甲基化來(lái)影響整個(gè)組蛋白結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的[14]。

在開(kāi)花天數(shù)上，sdg8相對(duì)于野生型Col開(kāi)花時(shí)期更早，BolSDG8RNAi相對(duì)sdg8較晚，但明顯早于Col，兩者相對(duì)于Col都有明顯的早花現(xiàn)象。在蓮座葉數(shù)目上，BolSDG8RNAi更接近于sdg8，兩者相對(duì)于Col在蓮座葉數(shù)目上都較少。該試驗(yàn)結(jié)果基本符合試驗(yàn)預(yù)期，證明Bolsdg8與sdg8不但具有高度相似的序列和結(jié)構(gòu)，在調(diào)控開(kāi)花的生理功能上也十分類似。

甘藍(lán)型油菜是甘藍(lán)與白菜雜交后自然加倍而成的異源四倍體，具有來(lái)源于甘藍(lán)的一對(duì)染色體，通過(guò)甘藍(lán)早花基因BolSDG8的研究，將為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜開(kāi)花機(jī)制，以及為選育適當(dāng)早花早熟的甘藍(lán)型油菜新品種來(lái)適應(yīng)“稻稻油”耕作制度提供理論參考。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

參考文獻(xiàn)

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NG D W，WANG T，CHANDRASEKHARAN M B，et al.Plant SET domain-containing proteins：Structure， function and regulation [J].Biochim Biophys Acta， 2007， 1769（5/6）：316-329.

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