熊志勇等

摘要[目的]探討不同因素對超聲波協(xié)同酶法提取茶多酚效果的影響，優(yōu)化茶多酚提取工藝。[方法] 為研究超聲波-酶法在茶葉中提取茶多酚的應(yīng)用效果，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察水浴溫度、水浴超聲時(shí)間、加酶量、茶多酚與纖維素酶的料液比和乙醇濃度對超聲波-酶法提取茶多酚的影響，從而優(yōu)化提取條件與工藝方法。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，提取時(shí)間對茶多酚的提取影響最顯著，優(yōu)化得出最佳工藝條件為：水浴時(shí)間40 min，加酶量10 ml，水浴溫度60 ℃，料液比為5∶50 g/ml，pH為5時(shí)，茶多酚提取率最高。[結(jié)論]超聲波-酶法應(yīng)用于茶葉中茶多酚的提取具有省時(shí)、節(jié)能、高效等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞茶葉；茶多酚；超聲波；纖維素酶

中圖分類號S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號0517-6611（2015）24-218-03

茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物的混合物，占茶葉質(zhì)量的20%～30%，安全性好且來源豐富，是一種天然無毒的食品添加劑，具有良好的抗氧化性能和藥理作用[1]。茶多酚具有抗氧化、抗突變、抗癌變[2]、抗衰老、清除自由基、降血壓與膽固醇等生物學(xué)功能。因此，茶多酚在食品、油脂、保健、醫(yī)藥、日化等行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用[3]。

超聲波提取是基于超聲波的空化作用來加速物質(zhì)分子盈動(dòng)的頻率和速度，增加溶劑穿透能力，以提高藥物溶出速度和次數(shù)，從而有利于植物有效成分的提取，而它的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于植物中有效成分的提取，超聲波提取還避免了高溫加熱對有效成分的破壞[4-5]。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。在分解纖維素時(shí)起生物催化作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)或RNA[6-7]。在自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，真菌產(chǎn)量高、活性大，種類繁多，來源很廣。并且，纖維素酶只是破壞茶葉的細(xì)胞壁，對非纖維素類物質(zhì)無影響，所以對茶多酚無影響。

從茶葉中提取茶多酚的傳統(tǒng)工藝存在許多缺點(diǎn)[8]，如溶劑消耗量大、毒性強(qiáng)、成本高、提取物收率低等。為了克服上述方法的弊端，筆者對其提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究超聲波協(xié)同酶法[9]，去除茶多酚提取量的影響（由于乙醇對纖維素酶活力有抑制作用，所以試驗(yàn)時(shí)在酶液作用之后再加入乙醇溶液保溫一段時(shí)間后再進(jìn)行測量茶多酚含量，正文不再進(jìn)行詳細(xì)說明），優(yōu)化最佳提取條件與工藝方法[10]，從而最大限度地提取茶多酚，為其在各個(gè)領(lǐng)域上的應(yīng)用做出一定的貢獻(xiàn)。

1材料與方法

1.1材料

原料：茶葉，山東日照鑫輝百貨。主要試劑：乙酸銨、磷酸、乙酰丙酮、液體石蠟、冰乙酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司（江蘇銳陽）；纖維素酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；試劑均為分析純。

主要儀器：

HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB2512DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；722S722見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1纖維素酶活力。

1.2.1.1纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

準(zhǔn)確稱取5 g纖維素酶，置于燒杯中溶解，倒入1 000 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，此纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5 mg/ml。

1.2.1.2濾紙酶活力。

濾紙酶活力（U/g）依據(jù)公式：濾紙酶活力（U/g）=葡萄糖生成量（mg）×酶液定容體積×556/[反應(yīng)液中酶液加入量（ml）×樣品重（g）×?xí)r間（h）]，由濾紙酶活力計(jì)算公式得，濾紙酶活力=547.104 U/g。

1.2.2茶多酚含量的測定。

原理：茶葉磨碎樣中的茶多酚用70 %的甲醇在70 ℃水浴上提取，福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色，最大吸收波長λ為765 mm，用沒食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚。

結(jié)果計(jì)算公式如下：

茶多酚含量（%）=A×V×dSLOPEstd×m×106×m1×100

式中，A為樣品測試液吸光度；

V為樣品提取液體積，10 ml；

d為稀釋因子（為1 ml稀釋成100 ml，故其稀釋因子為100）；

SLOPEstd為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

m為樣品干物質(zhì)含量（%）；

m1為樣品質(zhì)量（g）。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

擬合曲線方程：A= 0.008 6c+0.478 6；

擬合參數(shù)情況：SSE為2.56e-05；R2為0.999 7；R2adj為0.999 5；RMSE為0002 921。

1.2.3單因素試驗(yàn)考察。

在保持其他因素不變的條件下，以茶多酚含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別研究了水浴溫度、水浴超聲時(shí)間、加酶量、茶多酚與纖維素酶的料液比、乙醇濃度和pH對茶多酚提取的影響。

準(zhǔn)確稱取干燥的茶葉粉末5 g用于試驗(yàn)。水浴溫度采用的水平為：30、40、50、60 ℃；水浴超聲時(shí)間采用的水平為：30、40、50、60、70 min；加酶量采用的水平為：5、10、15、20、25 ml；料液比采用的水平為：5∶40、5∶50、5∶60、5∶70、5∶80 g/ml；乙醇濃度采用的水平為：15%、35%、55%、75%、95%；pH采用水平為3、4、5、6、7。

1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)茶葉中茶多酚的提取條件，選定水浴溫度（A）、水浴超聲時(shí)間（B）、加酶量（C）、料液比（D）和pH（E）為考察因素，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表1。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析。

采用正交試驗(yàn)軟件對正交結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳提取工藝條件。

1.2.6超聲波與纖維素酶對茶多酚提取率的影響。

選取相同原料，采用相同測定方法，分別采用超聲波不加酶、加酶不超聲法和超聲波協(xié)同酶法試驗(yàn)，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1水浴溫度的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，分別于30、40、50、60 ℃時(shí)加入5 ml酶液和50 ml 75%乙醇，作用1 h，結(jié)果如圖2所示，在50 ℃時(shí)茶多酚的提取量比較高。

2.1.2水浴超聲時(shí)間的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，于50 ℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml 75%乙醇，分別作用30、40、50、60、70 min，結(jié)果由圖3可見，水浴時(shí)間為60 min時(shí)茶多酚提取量為最高。

2.1.3加酶量的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，于50 ℃時(shí)以料液比為5∶50 g/ml加入酶液5、10、15、20、25 ml及75%乙醇分別作用50 min，結(jié)果由圖4可見，加酶量為15 ml時(shí)茶多酚的提取量比較高。

2.1.4料液比的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，于50 ℃時(shí)加入20 ml酶液和40、50、60、70、80 ml 75%乙醇溶液作用50 min，結(jié)果由圖5可見，料液比為5∶60 g/ml時(shí)茶多酚的提取量為最高。

2.1.5乙醇濃度的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，于50 ℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml，15%、35%、55%、75%、95%乙醇，分別作用50 min，結(jié)果由圖6可見，乙醇濃度為55%時(shí)茶多酚的提取量比較高。

2.1.6pH的確定。

稱取干燥的茶葉粉末5 g，于50 ℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml 75%乙醇，分別作用50 min，結(jié)果由圖7可見，pH為4的時(shí)候茶多酚的提取率最高。

從試驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，超聲波協(xié)同酶法提取茶多酚確實(shí)比普通的提取方法所提取的含量有所提高，但增幅不是很明顯。經(jīng)過分析研究，可能的原因是由于茶多酚的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其跟蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的絡(luò)合作用，所以容易導(dǎo)致活性酶的失活。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得知各因素對提取結(jié)果的影響，確定正交試驗(yàn)水平，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2

可見，各因素對試驗(yàn)指標(biāo)（茶多酚含量）的影響按大小次序來說依次是：提取時(shí)間、 pH、溫度、料液比、加酶量。

最好的試驗(yàn)提取條件為A4B2C2D2E3，即水浴時(shí)間40 min，加酶量10 ml，水浴溫度60 ℃，料液比為5∶50 g/ml，pH為5。

茶多酚提取方差分析顯示，F(xiàn)溫度=0.607，F(xiàn)時(shí)間=3.380，F(xiàn)加酶量=0.174，F(xiàn)料液比=0.233，F(xiàn)pH=0.606，F(xiàn)臨界=3.29。

由此可得，時(shí)間這個(gè)因素對茶多酚的提取有較顯著的影響，說明時(shí)間對茶多酚的提取起主要作用，溫度、加酶量、料液比和pH則沒有顯著性差異，即這些因素對茶多酚的提取影響較小。

2.3超聲波與纖維素酶對茶多酚提取率的影響

試驗(yàn)得出，超聲波協(xié)同纖維素酶法提取茶多酚的提取量最高，5 g茶葉粉中茶多酚提取量為23.216 4 mg，其提取效果明顯高于單一的超聲波（21164 8 g）和加酶法（22.845 7 g）。

3結(jié)論與討論

纖維素酶是一種能夠?qū)⒕S生素降解成葡萄糖的酶的總稱，其作用主要是破壞茶葉細(xì)胞的細(xì)胞壁，使其內(nèi)部物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來，由于茶多酚并不是纖維素類物質(zhì)，故對提取出來的茶多酚的成分不會(huì)有影響。超聲波提取法是基于超聲波的空化作用來加速物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度，增加溶劑的穿透能力，以提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)，從而有利于植物有效成分的浸出提取，而他的次級效應(yīng)也能加速提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于絕大部分植物有效成分的提取，還可避免高溫加熱對有效成分的破壞。

通過超聲波與酶間不同組合試驗(yàn)方法的比較，可知纖維素酶的提取效率高于超聲波的提取效率，而且超聲波與纖維素酶具有協(xié)同作用，共同增進(jìn)茶多酚的提取效率；通過5因素4水平正交試驗(yàn)的優(yōu)化工藝研究，得出水浴時(shí)間40 min，加酶量10 ml，水浴溫度60 ℃，料液比為5∶50 g/ml，pH為5時(shí)茶多酚的提取效率最高，其中影響因素以時(shí)間、pH和溫度為主。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣麗，王雪梅，全學(xué)軍，等.不同提取方法對茶多酚理化性質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2010，31（14）：136-139.

[2] YANG C S，LI G X，YANG Z H，et al.Cancer prevention by tocopherols and tea polyphenols[J].Cancer Letters，2013，334（1）：79-85.

[3]THAKUR V S，GUPTA K，GUPTA S.The chemopreventive and chemotherapeutic potentials of Tea polyphenols[J].Current Pharmaceutical Biotechnology，2012，13（1）：191-199.

[4] 吳昊，宗志敏，石金龍.超聲波協(xié)同酶法提取銀杏黃酮的工藝研究[J].中國資源綜合利用，2012，30（11）：26-29.

[5] 陳紅，崔海月，李玉擴(kuò)，等.超聲波協(xié)同酶法提取大豆多糖工藝的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（5）：581-586.

[6] LI C Z，YOSHIMOTO M，F(xiàn)UKUNAGA K，et al.Characterization and immobilization of liposomebound cellulase for hydrolysis of insoluble cellulose[J].Bioresource Technology，2006，98（7）：1366-1372.

[7] TBKA I R M，SILVA A G L，PETRI D F S.Hydrolytic activity of free and immobilized cellulase[J].Langmuir，2009，25（3）：1582-1587.

[8] 劉軍海，楊海濤，刁宇清.復(fù)合酶法提取茶多酚工藝條件研究[J].食品與機(jī)械，2008，24（3）：74-77.

[9] 陶濤，李立祥，張芳，等.超聲波協(xié)同纖維素酶對黃精多糖和皂苷的提取研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（9）：271-275.

[10] 陳紅，崔海月，李玉擴(kuò)，等.超聲波協(xié)同酶法提取大豆多糖工藝的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（5）：581-586.