周璐　陳孝男　開鈞等

摘要形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)研究表明，文昌魚是脊索動物中的基底生物，是研究脊椎動物形態(tài)、發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的起源與進化的重要模式生物。隨著比較免疫學(xué)的迅速發(fā)展以及佛羅里達文昌魚基因組測序的完成，關(guān)于文昌魚免疫的研究越來越引起人們的關(guān)注。在NCBI數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)方法結(jié)合進化分析了文昌魚IKK基因在進化中的地位。

關(guān)鍵詞文昌魚；IKK基因；進化

中圖分類號S917；Q953文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）28-142-03

Evolution Analysis of Amphioxus IKK

ZHOU Lu1，2， CHEN Xiaonan1， KAI Jun1 et al

（1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210023； 2. College of Life Science， Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210023）

AbstractBoth morphological and molecular evidence show that amphioxus is the basal chordate and is a crucial organism for understanding the chordate evolution including the origin of the immune system， morphology and development. With the rapid development of comparative immunology， as well as the completion of Branchiostoma floridae genome sequencing， the attention was focused on amphioxus immune increasingly. Therefore， this study on the basis of NCBI database， used molecular biology methods to analyze the Amphi IKK gene evolution.

Key wordsAmphioxus； IKK； Evolution

文昌魚（Amphioxus）隸屬脊索動物門、頭索動物亞門、頭索綱。這類動物存在縱貫全身的脊索，不僅終生保留，而且延伸到背神經(jīng)管的前方，因此被稱頭索動物。它們習慣上被認為是最接近脊椎動物的一個物種，在討論脊椎動物的起源方面一直占據(jù)著重要地位。雖然最近的分子系統(tǒng)生物學(xué)分析將海鞘放在與脊椎動物最接近的位置，但是頭索動物仍然是脊索動物中最基底的動物[1-2]。隨著2008年文昌魚基因組測序工作的完成，通過頭索動物與脊椎動物基因組的比較，設(shè)想出一幅脊索動物共同祖先基因組的假圖，為脊椎動物起源與進化研究提供了重要的材料[3]。1993年，Holland等于弗洛里達文昌魚中克隆到第1個發(fā)育調(diào)控基因——Hox3[4]，迄今為止已有超過500個被克隆出的文昌魚發(fā)育功能基因提交到GenBank中。IκB激酶復(fù)合物（IκB kinase complex，IKK）作為核因子κB（Nuclear factor kappa B，NFκB）信號途徑的重要調(diào)控因子，能夠接觸IκB對NFκB的抑制，從而激活參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫細胞活化、增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5-7]。筆者以白氏文昌魚（Branchiostoma belcheri）的IKK基因為參照，對17個物種24個IKK基因進行遺傳進化分析。

1材料與方法

1.1分析軟件

Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）[8]（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）：用于序列的BLAST分析；MatGAT[9] 2.01：用于相似性和一致性分析；MEME Suite[10]（http：//meme.nbcr.net/meme/）：用于motif預(yù)測分析；BioEdit[11] 7.0.9.0[12] Sequence Alignment Editor（http//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html）：用于氨基酸序列的比對；MEGA 5.0[13]：用于系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。

1.2分析方法

①使用NCBI網(wǎng)站上的BlastX對IKK基因的序列進行同源分析；②將IKK基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行BlastP分析，下載與其相似性較高的其他物種IKK家族基因的氨基酸序列；③運用MatGAT對文昌魚和其他不同物種的IKK蛋白進行相似性和一致性分析；④利用BioEdit Sequence Alignment Editor對在NCBI網(wǎng)站上下載的經(jīng)過試驗驗證的其他物種IKK蛋白的氨基酸序列及文昌魚IKK蛋白的氨基酸序列進行比對；⑤在BioEdit Sequence Alignment Editor序列比對的基礎(chǔ)上，使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2結(jié)果與分析

2.1IKK基因的氨基酸序列的同源性比較

將白氏文昌魚IKK蛋白的氨基酸序列（GenBank 登錄號：AFS65343）在NCBI網(wǎng)站上進行同源性比對分析，共篩選出17個物種24個IKK基因（表1），進行后續(xù)分析。

將IKK蛋白的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進行同源性比對分析，經(jīng)SMART在線軟件預(yù)測，白氏文昌魚IKK蛋白與哺乳動物IKK蛋白一樣，具有一個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（serine/threonine kinase domain，KD，residues 30～324AA），在這個結(jié)構(gòu)域中，含有1個絲氨酸/蘇氨酸激酶活化位點（serine/threonine kinase active site，residues 154～168AA）和一個保守的MAPKK活化莖環(huán)（MAPKK activation loop，SerXXXSer motif，residues 192～196AA）。與人類的IKKα和IKKβ相比，文昌魚IKK蛋白具有一個潛在的螺旋-環(huán)-螺旋基序（helixloophelix motif，HLH，residues 421～464AA），一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（a leucine zipperlike amphipathic αhelix，LZ，residues 552～609AA）和一個羧基端的NEMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域（a Cterminal NEMObinding domain，NBD，residues 719～756AA）（圖1）。

將白氏文昌魚IKK蛋白與其他物種（表1）的IKK蛋白進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，文昌魚與合浦珠母貝（Pinctada fucata）的IKK蛋白一致性最高（43.3%），與其他物種的相似性為44.3%～64.0%，一致性為24.6%～43.3%（表2）。

2.2IKK蛋白的比對分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

利用BioEdit 7.0.9.0 Sequence Alignment Editor軟件對以上蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行多重序列比對，然后再利用MEGA 5.0使用Bootstrap NeighborJoining Method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

從表2可以看出，主要聚為2支，第一支為無脊椎動物，主要分為2個分支，一個分支為昆蟲，另一個分支為軟體動物和頭索動物；另一支為脊椎動物，分為IKKα和IKKβ 2個部分。文昌魚IKK介于無脊椎動物和脊椎動物，較高的BOOTSTRAP值（1 000 replicates）表明拓樸結(jié)構(gòu)的精確性。

3討論

筆者對白氏文昌魚IKK基因的全長序列進行了分析，NCBI網(wǎng)站上的Blast分析表明文昌魚中的IKK與其他物種的IKK蛋白有很高的相似性。相似性和一致性分析表明，文昌魚IKK與以前發(fā)現(xiàn)的IKK蛋白存在44.3%～64.0%的相似性和24.6%～43.3%的一致性。文昌魚IKK蛋白與哺乳動物IKK蛋白一樣，具有1個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，在這個結(jié)構(gòu)域中含有1個絲氨酸/蘇氨酸激酶活化位點和1個保守的MAPKK活化莖環(huán)。與人類的IKKα和IKKβ相比，文昌魚IKK蛋白具有一個潛在的HLH基序、一個LZ結(jié)構(gòu)和NBD結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，文昌魚IKK介于無脊椎動物和脊椎動物，與合浦珠母貝、太平洋牡蠣更為接近。在經(jīng)典的NFκB信號通路中，IKK復(fù)合體的活化和IκB的降解是一個標志性事件[14]。NEMO的Lys 63linked的多聚泛素化是IKK復(fù)合體活化的必要前提，這個過程需要TAK1磷酸化IKKβ的保守MAPKK活化莖環(huán)[15-16]。該研究中文昌魚IKK蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域中具有2個絲氨酸殘基（Ser192和Ser196）；羧基端具有NEMO的結(jié)合位點，這些保守的結(jié)構(gòu)表明文昌魚IKK是IKK家族的一名新成員。該研究不但能夠更好地了解IKK基因的功能和進化，而且能夠為其他無脊椎動物IKK基因研究提供新的線索。

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