姚瓊等

摘要選取在E.coli中對于dsRNA表達(dá)比較重要的3個因素，即誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度。利用已經(jīng)構(gòu)建好的大腸桿菌E.coli HT115（DE3），并結(jié)合正交試驗設(shè)計研究dsRNA在HT115（DE3）內(nèi)的最優(yōu)表達(dá)條件。結(jié)果表明，工程菌在誘導(dǎo)時間8 h、誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)劑濃度10.0 mmol/L的培養(yǎng)條件下所得到的dsRNA表達(dá)量最大。

關(guān)鍵詞大腸桿菌HT115（DE3）；dsRNA ；表達(dá)條件；正交試驗

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）24-024-02

1998年Fire等將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA（正義RNA （sense RNA）和反義RNA（antisense RNA））注射到線蟲Caenorhabditis elegans體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)兩者都能夠特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)了特異性的基因沉默（gene silencing），該小組將此現(xiàn)象稱為RNA干涉（RNA interference，簡稱RNAi）。目前，RNAi技術(shù)已在多種模式生物如線蟲（Caenorhabditis elegans）、果蠅（Drosophila melanogaster）、小鼠（moth）等體內(nèi)實現(xiàn)，通常是用dsRNA（doublestranded RNA）介導(dǎo)基因沉默作用，dsRNA作為RNAi作用的前導(dǎo)物質(zhì)，對于干擾作用的發(fā)生起著決定性作用。以dsRNA為基點研究基因沉默的分子機(jī)制成為熱點。

在線蟲C.elegans中，只需導(dǎo)入少量的dsRNA即可實現(xiàn)高效的RNAi效果，但哺乳動物和果蠅中不存在RNAi的放大機(jī)制，即導(dǎo)入dsRNA后產(chǎn)生的RNAi作用不持久，具有瞬時性。為了克服此缺點，研究者發(fā)展了基于DNA載體在動植物體內(nèi)表達(dá)dsRNA的技術(shù)。這種載體可以是質(zhì)粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段。先在體外構(gòu)建能表達(dá)dsRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)合成dsRNA，不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類，而且在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中，dsRNA能夠長期穩(wěn)定表達(dá)，省時省力且高效。因此，應(yīng)用合適的表達(dá)載體表達(dá)dsRNA，對于采取喂食法和注射法實現(xiàn)的RNAi試驗起著至關(guān)重要的作用。

由于質(zhì)粒L4440作為表達(dá)載體具有含有雙向T7強(qiáng)啟動子，載體本身具有氨芐抗性，便于篩選等優(yōu)點，目前已成功用于多種RNAi試驗所需dsRNA的表達(dá)。在干擾載體構(gòu)建完成后克隆至大腸桿菌HT115（DE3）中，該菌含有T7 RNA聚合酶基因（λDE3 lysogen），它可在T7啟動子的控制下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生T7 RNA聚合酶。而且該菌有一個rnc基因突變，它是編碼特異性降解dsRNA的內(nèi)切酶RNaseⅢ的基因，有利于dsRNA的生成，這樣在IPTG誘導(dǎo)下在E.coli內(nèi)很容易產(chǎn)生dsRNA，另外，該菌為四環(huán)素抗性，轉(zhuǎn)入載體后具有雙抗性，便于篩選。因此，該表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建，可以快速經(jīng)濟(jì)地利用喂食法或注射法RNAi進(jìn)行生物體某個基因功能的研究。

dsRNA作為RNAi作用的前體分子，在生物體中合適量的dsRNA對RNAi的效果起到了很重要的作用，而大腸桿菌又是用于表達(dá)外源基因的較好載體。因此，利用大腸桿菌大量表達(dá)RNAi試驗所需的dsRNA并進(jìn)一步優(yōu)化其表達(dá)條件是必要的。筆者利用帶有空載質(zhì)粒L4440及重組質(zhì)粒LSA3的表達(dá)工程菌HT115（DE3），借助正交試驗設(shè)計優(yōu)化其表達(dá)dsRNA的條件（例如誘導(dǎo)溫度、時間等），便于后續(xù)的以喂食法或注射法介導(dǎo)的RNAi在靶標(biāo)生物體內(nèi)的實現(xiàn)。

1材料與方法

1.1載體與菌株菌株：HT115（DE3），美國斯坦福大學(xué)Fire教授贈送（美國國家線蟲遺傳學(xué)研究中心提供）。

質(zhì)粒L4440：美國斯坦福大學(xué)Fire教授贈送（美國麻省Addgene機(jī)構(gòu)提供）。

有外源基因插入的質(zhì)粒LSA3：在空載質(zhì)粒L4440中插入甜菜夜蛾（spodoptera exigua）幾丁質(zhì)合成酶A的一段長度為450 bp基因片段，該重構(gòu)質(zhì)粒由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室提供。

1.2試劑

蛋白胨（peptone）、酵母粉（yeast extract）購自O(shè)xoid公司產(chǎn)品；氨芐青霉素（ampcillin）、四環(huán)素（Tetracycline）購自廣州威佳科技有限公司；DNA markerIII 購自NEB公司；IPTG購自Merck公司；DEPC購自AMRESCO公司；Trizol購自天根生化科技（北京）有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇及其他常用的化學(xué)試劑購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3試驗方法

1.3.1目的基因在工程菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.3.1.1正交試驗設(shè)計。

大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的主要影響因素為誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度，采用L9（34）正交試驗表（表1）。

1.3.1.2目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

在2塊分別含LSA3、L4440質(zhì)粒的大腸桿菌平板上，用無菌牙簽挑取一些白色菌落，分別接種到3 ml LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/ml Amp、12.5 μg/ml Tet）中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h，活化。然后以1∶50轉(zhuǎn)接至2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4左右時，按試驗號加入相應(yīng)濃度IPTG，并根據(jù)各試驗號所需的條件誘導(dǎo)相應(yīng)的時間及溫度。

1.3.2菌體RNA的提取及檢測。

菌體RNA抽提采用傳統(tǒng)的Trizol提取法，并在該方法上稍作調(diào)整。

RNA質(zhì)量檢測手段包括瓊脂糖凝膠電泳檢測和分光光度計測定。稱取0.2 g Agrose溶于1×TAE緩沖液中，定容至20 ml，制成1%的電泳膠。將5 μl RNA樣品與1 μl 6×Loading Buffer充分混合后電泳檢測。將2 μl RNA樣品與498 μl DEPC水混勻（放大250倍），利用分光光度計檢測，記錄樣品的OD260、OD260/OD280及RNA濃度。

2結(jié)果與分析

2.1工程菌富集量直觀對比

試驗組與對照組組間對比：根據(jù)3次重復(fù)中菌液富集量情況，LSA3組與L4440組菌量無明顯差異。試驗組與對照組組內(nèi)對比：直觀上看，L4440組與LSA3組都存在一個現(xiàn)象，即25 ℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30 ℃、37 ℃這2種培養(yǎng)條件下的菌量少，但30 ℃與37 ℃條件下培養(yǎng)所得到的菌液濃度無明顯差異。

2.2菌體RNA的提取及RNA純度檢測

對3次重復(fù)所抽提的菌體RNA利用分光光度計檢測其純度，結(jié)果顯示，3次重復(fù)中所抽提的RNA純度較好，2個組OD260/OD280在1.7～2.00的樣品比例都為88.9%，說明樣品很少蛋白污染，且沒有RNA水解成單核苷酸的現(xiàn)象。

2.3正交試驗結(jié)果由表2可知，3個因素對結(jié)果的影響大小依次為A、B、C。即對于大腸肝菌HT115（DE3）生長誘導(dǎo)時間的作用最大，其次是誘導(dǎo)溫度，最后是誘導(dǎo)劑IPTG的濃度。

方差分析結(jié)果表明，3個因素對于試驗結(jié)果的影響并不顯著，誘導(dǎo)時間對于試驗結(jié)果有一定影響，而另外2個因素誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)劑濃度對試驗結(jié)果影響不明顯。

最佳組合為A3B2C3，即誘導(dǎo)時間8 h，誘導(dǎo)溫度30 ℃，誘導(dǎo)劑濃度10.0 mmol/L。

3結(jié)論與討論

先在體外構(gòu)建能表達(dá)dsRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)到細(xì)

胞內(nèi)合成dsRNA，可保證在細(xì)胞株中長期穩(wěn)定表達(dá)dsRNA，

有效發(fā)揮RNAi阻斷基因的效應(yīng)。該試驗選用E.coli HT115（DE3） （具有四環(huán)素抗性）作為材料，轉(zhuǎn)入含對應(yīng)目標(biāo)片段dsRNA的cDNA載體L4440（具有氨芐抗性）后具有雙抗性，便于篩選，這在IPTG誘導(dǎo)下在E.coli內(nèi)很容易產(chǎn)生dsRNA。

大腸肝菌表達(dá)外源基因的影響因素很多，該試驗選用影響較大的幾項：誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間。因為工程菌表達(dá)外源基因的條件因基因不同也相應(yīng)不同，因此設(shè)定了這3個影響因素的3個水平以期得到E.coli HT115（DE3）表達(dá)目的基因的最優(yōu)條件。而試驗組LSA3收菌量略小于空白對照組L4440，可能的原因是：外源基因的存在對菌體的生長有一定影響。25 ℃培養(yǎng)條件下富集得到的菌量普遍比30 ℃、37 ℃這2種培養(yǎng)溫度下的菌量少，但30 ℃與37 ℃溫度下培養(yǎng)得到的菌量差別不大，造成這一現(xiàn)象可能的原因是工程菌E.coli HT115（DE3）的生長受溫度影響較大，25 ℃并不是其適宜生長溫度，其生長最適溫度是30～37 ℃。

正交試驗設(shè)計是一種解決多因素優(yōu)化問題的卓有成效的方法。該試驗采用正交試驗設(shè)計研究了dsRNA在HT115（DE3）內(nèi)的最優(yōu)表達(dá)條件。結(jié)果表明，最適合工程菌E. coli HT115（DE3）生長并表達(dá)dsRNA的最佳組合為A3B2C3，即誘導(dǎo)時間8 h、誘導(dǎo)溫度30 ℃，誘導(dǎo)劑濃度10.0 mmol/L。

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