趙春雷等

摘要

[目的]探討培養(yǎng)基起始pH、碳源、氮源和發(fā)酵溫度對高產纖維素酶菌株B.subtilis SD76產酶的影響。[方法]通過正交分析確定菌株B.subtilis SD76產纖維素酶（CMCase）的最佳培養(yǎng)條件。[結果]菌株B.subtilis SD76產酶的最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH 6.8；培養(yǎng)基稻草粉濃度3.0 g/L；硫酸銨濃度3.5 g/L，發(fā)酵溫度32 ℃。在最佳培養(yǎng)條件下，該菌株的CMCase活力達到462.34 U。[結論]為提高B.subtilis SD76產纖維素活力和該菌株的工業(yè)產酶生產提供一定的參數和應用依據。

關鍵詞纖維素酶；發(fā)酵條件；酶活性；正交試驗

中圖分類號S188；FQ920.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）24-020-02

纖維素是高等植物細胞壁的主要成分，是生物圈中最廉價、最大量永不枯竭的可再生性碳源資源。地球上植物體每年通過光合作用生成數千億噸有機資源，其中三分之一以上為纖維素資源。但這些儲存的能量和碳，植物體自身并不重復利用，絕大部分纖維素資源如枯枝落葉等只能廢棄到環(huán)境中，造成了資源的巨大浪費和環(huán)境的污染。有效地轉化、開發(fā)和利用這一豐富天然資源，對于解決工農業(yè)原料來源、能源危機、環(huán)境污染等具有重要的現實意義。

目前，生物降解是纖維素降解方面研究最經濟、環(huán)保的方法。但在生物降解應用過程中，除選育高產優(yōu)良纖維素酶（CMCase）菌株外，產酶發(fā)酵條件同樣非常重要。即使同一菌種，若培養(yǎng)基類型、實驗設備及發(fā)酵條件不同，菌種產酶的能力也存在較大差異。對于不同菌種，則產酶差異更大。因此，筆者以大圍山原始森林土壤中篩選出一株產纖維素酶活力高的菌株B.subtilis SD76為出發(fā)菌，探討培養(yǎng)基起始pH、碳源、氮源和發(fā)酵溫度對高產纖維素酶菌株B.subtilis SD76產酶的影響，并通過正交分析確定產纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，以期為提高B.subtilis SD76產纖維素活力和該菌株的工業(yè)產酶生產提供一定的參數和應用依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：B. subtilis SD76，分離自云南大圍山原始森林土壤。

產酶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，硫酸銨4 g，磷酸二氫鉀2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，加水至1 000 ml。121 ℃，滅菌30 min后冷卻備用。

其他原料：碳源：麩皮，玉米芯，羧甲基纖維素（CMC），玉米秸稈，稻草粉，豆渣。麩皮、玉米芯、玉米秸稈用小型粉碎機進行粉碎，過20目篩后備用。氮源：2.0 g/L牛肉膏，2.0 g/L蛋白胨，4.0 g/L酵母粉，1.5 g/L硫酸銨，2.5 g/L硝酸鈉，1.5 g/L氯化銨。

1.2 試驗方法

1.2.1

初始pH對B.subtilis SD76產酶的影響。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將培養(yǎng)基初始pH分別調制成2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8，接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定其酶活力。每組3個平行。

1.2.2

溫度對B.subtilis SD76產酶的影響。將接種B.subtilis SD-76后的產酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于24、26、28、30、32、34和36 ℃，恒溫培養(yǎng)72 h后，測定其酶活力。每組3個平行。

1.2.3

碳源對B.subtilis SD76產酶的影響。分別以麩皮、玉米芯、CMC、玉米秸稈、稻草粉、豆渣作為唯一碳源，培養(yǎng)基經121 ℃高壓滅菌，接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定其酶活力。每組3個平行。

1.2.4

氮源對B.subtilis SD76產酶的影響。

分別將牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨溶解于10 ml水中，分別加入裝有10 g稻草粉的250 ml三角瓶中，攪拌均勻，121 ℃滅菌接種后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，測定其酶活力。每組3個平行。

1.2.5

發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化試驗。在單因素發(fā)酵產酶的基礎上，以初始pH、發(fā)酵溫度、稻草粉濃度、硫酸銨濃度4個因素作為影響菌株B.subtilis SD76發(fā)酵生產纖維素酶的主要因子。設計4因素3水平正交試驗，因素水平見表1。

1.2.6

纖維素酶活性測定。CMCase酶活的測定參照文獻[5]。

1.3數據分析

試驗數據采用SPASS 16.0軟件進行分析。

2結果與分析

2.1初始pH對B.subtilis SD76產酶的影響

由圖1可知，當培養(yǎng)基初始pH在2.8～6.8時，隨著pH的升高，菌株B.subtilis SD76產纖維素酶呈上升趨勢，當初始pH 6.8時纖維素酶活力達到最大值392.83 U。當培養(yǎng)基初始pH大于6.8后，隨著pH的增加菌株B.subtilis SD76產纖維素酶呈下降趨勢。因此選擇起始pH 6.8。

2.2溫度對B.subtilis SD76產酶的影響

由圖2可知，當溫度在20～30 ℃時，隨著發(fā)酵溫度增加，菌株B.subtilis SD76產纖維素酶呈上升趨勢，當發(fā)酵溫度為30 ℃時纖維素酶活力最高，可達395.47 U。而纖維素酶活力達到最高值后，隨發(fā)酵溫度繼續(xù)升高則產酶下降?？梢姲l(fā)酵溫度對產酶效果有明顯影響，因此發(fā)酵溫度選擇 30 ℃。

2.3碳源對B.subtilis SD76產酶的影響

由圖3可知，所選的幾種碳源都能使B.subtilis SD76產酶，但不同的碳源，產酶量不同。產酶量最高的是稻草粉，其次為玉米芯、豆渣、CMC和玉米秸稈，最低的是麩皮。

2.4氮源對B.subtilis SD76產酶的影響

由圖4可知，所選用的幾種氮源都能使B.subtilis SD76產酶，但不同的氮源，產酶量不同。其中硫酸銨為氮源能夠有效提高產纖維素酶的能力，因此選擇硫酸銨作為氮源。

2.5 菌株B.subtilis SD76的最佳產酶條件

對正交試驗各搖瓶編號的提取酶液，測定CMCase活性。結果見表2。

由表2可知，以CMCase活力為衡量指標時，初始pH、發(fā)酵溫度、稻草粉濃度、硫酸銨濃度4個因素對酶活力大小影響次序為A、B、C、D，即影響B(tài). subtilis SD76產酶最大的是培養(yǎng)基初始pH，其次為發(fā)酵溫度、硫酸銨濃度和稻草粉濃度。B. subtilis SD76產纖維素酶的最佳條件為A3B3C2D3，即發(fā)酵最佳條件為pH 6.8，溫度32 ℃，稻草粉濃度3.0 g/L，硫酸銨濃度為3.5 g/L，該菌株的酶活達到462.34 U。

3結論

（1）適合該菌株B. subtilis SD76液體搖瓶發(fā)酵的碳源為稻草粉；氮源為硫酸銨；培養(yǎng)基初始pH為6.8；發(fā)酵溫度為30 ℃。在最適pH和最適溫度下培養(yǎng)，該菌株的纖維素酶活力分別達到392.83和395.47 U。

（2）菌株B. subtilis SD76的最佳產酶條件為：培養(yǎng)基初始pH為6.8；發(fā)酵溫度為32 ℃；稻草粉濃度為3.0 g/L；硫酸銨濃度為3.5 g/L。在最佳條件下培養(yǎng)，該菌株的酶活達到462.34 U。

參考文獻

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