劉燕青，黃 健，黃韻祝＊＊＊，婁方方，孔維瑩

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 生化科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)2 屬于I 類HDACs 家族成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1］。HDAC 能調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，當(dāng)HDAC 過(guò)量或乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HATs)的數(shù)量減少時(shí)，組蛋白乙酰化的平衡將偏向去乙?；?，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)異常［1］。RNA 干擾(RNAi)技術(shù)是目前使用最廣泛的功能基因組學(xué)研究手段，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，具有高效率、高特異性、高穩(wěn)定性和高穿透性等優(yōu)點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)參照HDAC2 基因序列，設(shè)計(jì)合成短發(fā)夾RNA(shRNA)結(jié)構(gòu)的雙鏈寡核苷酸片段，插入慢病毒表達(dá)載體pLKO.1-puro，構(gòu)建并篩選針對(duì)人HDAC2 基因特異性的慢病毒干擾載體，為進(jìn)一步研究HDAC2 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

pLKO.1-puro 慢病毒表達(dá)載體(美國(guó)addgene公司)，LB 培養(yǎng)基(OXID)，T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶AgeI、EcoRI 和XhoI(NEB 公司)，DNA 凝膠回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒(北京TIANGEN 公司)，stbl2 大腸桿菌(實(shí)驗(yàn)室保存)，20 bp、1 kb DNA Ladder(Takara)，氨芐青霉素(sigma 公司)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、DNA 測(cè)序試劑盒(Invitrogen 公司)，引物由上海捷瑞生物公司合成;熒光倒置顯微鏡(NIKON)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 特異性shRNA 干擾載體的設(shè)計(jì) 人HDAC2 shRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì):根據(jù)Sigma 公司干擾靶點(diǎn) 信 息(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes/HDAC2?lang=zh＆region=CN)，挑選出3條基因特異性shRNA 序列(Human，HDAC2，NM_001527)，通過(guò)BLAST 同源性分析，排除非特異性抑制其他基因序列的可能。序列3＇端加入終止信號(hào)TTTTT，兩端分別加入限制性內(nèi)切酶AgeI 和EcoRI 的酶切位點(diǎn)黏性末端，中間加入Loop 環(huán)，構(gòu)成的引物結(jié)構(gòu)(AgeI 酶切位點(diǎn)+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+EcoRI 酶切位點(diǎn));HDAC2-shRNA 序列見(jiàn)表1。

表1 針對(duì)人HDAC2 基因序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸片段Tab.1 Oligonucleotide sequences of HDAC2 specific shRNAs

1.2.2 Oligo DNA 片段退火、線性質(zhì)粒載體pLKO.1-puro 獲得 將合成的八條Oligo 片段用pH 8.0 的TE 溶液稀釋成100 μmol/L，按照下列體系進(jìn)行退火反應(yīng)，正向序列引物1 μL，反向序列引物1 μL，10×NEB buffer2 5 μL，雙蒸水(ddH2O)43 μL;反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，70 ℃10 min，室溫自然冷卻，形成雙鏈Oligo DNA 片段，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙鏈Oligo DNA 的完整性，產(chǎn)物于-20℃保存。挑取攜帶pLKO.1-puro 質(zhì)粒的甘油菌接種含100 mg/L 氨芐青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑5 個(gè)單克隆增菌，提取質(zhì)粒。在37 ℃用AgeI 和EcoRI 雙酶切500 ng pLKO.1-puro 質(zhì)粒載體使之線性化，酶切產(chǎn)物用0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠切割回收7 kb 的pLKO.1-puro 骨架大片段，20 μL ddH2O 洗脫。

1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞制備 挑取4 ～6 個(gè)單克隆菌落接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min振蕩過(guò)夜。按1∶50 ～100 比例將上述菌液接種到100 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min 搖菌5 ～6 h，將菌液置冰上冷卻，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，回收菌體，加入預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸，再4℃，4 000 r/min 離心10 min，回收沉淀，向細(xì)胞沉淀中加入冰上預(yù)冷的含15%甘油的CaCl2溶液重懸，分裝，放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 pLKO.1-HDAC2-shRNA 質(zhì)粒構(gòu)建 將各組退火后的雙鏈Oligo DNA 片段與線性化pLKO.1-puro 干擾載體進(jìn)行連接，連接體系:雙鏈Oligo DNA 2 μL，線性化pLKO.1-puro 20 ng，10×NEB T4 DNA ligase buffer 2 μL，加ddH2O 至19 μL，在1μL T4 DNA 連接酶的作用下于16 ℃連接過(guò)夜;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌stbl2 感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃取出100 uL/支stbl2 感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，各組分別加入9 μL 連接產(chǎn)物，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，迅速冰浴3 min，然后加入891 uL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h。待細(xì)菌復(fù)蘇后離心取沉淀涂布含100 mg/L 氨芐青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃正置培養(yǎng)30 min，待平板上液體完全吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.5 重組質(zhì)粒篩選與鑒定 線性化pLKO.1-puro 與目的基因shRNA 序列連接轉(zhuǎn)染大腸桿菌stbl2 感受態(tài)細(xì)胞，挑選5 個(gè)單克隆菌落接種到含100 mg/LAmp 的LB 培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 ～18 h。提取重組質(zhì)粒載體分別進(jìn)行XhoI、EcoRI 單酶切驗(yàn)證。酶切反應(yīng)條件為重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 10 μL，XhoI 或EcoR I 1 μL，Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL，置37 ℃孵育2 h，70 ℃、15 min 終止反應(yīng)，pLKO.1-puro 質(zhì)粒采用AgeI、EcoRI 酶切，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI，pLKO.1-HDAC2-shRNA 經(jīng)XhoI 單酶切驗(yàn)證，酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果，pLKO.1-puro 質(zhì)粒可見(jiàn)7 kb 和1.9 kb 兩條特異性條帶，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI 后可見(jiàn)1 條約7 kb 特異性條帶，pLKO.1-HDAC2-shRNA 經(jīng)XhoI 單酶切后可見(jiàn)6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 條特異性條帶，提示外源序列插入成功。挑取酶切鑒定證實(shí)為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒菌液送上海Invitrogen 公司進(jìn)行DNA 測(cè)序鑒定。對(duì)測(cè)序正確序列的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，分裝，-20 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 寡核苷酸退火產(chǎn)物的鑒定

將3 組針對(duì)HDAC2 基因靶點(diǎn)特異性shRNA及陰性對(duì)照退火后行4%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在60 bp 處可見(jiàn)目的條帶，與預(yù)期相對(duì)分子大小相符，說(shuō)明干擾片段退火成功，見(jiàn)圖1。

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

pLKO.1-puro 質(zhì)粒經(jīng)AgeI、EcoRI 酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到7 kb 和1.9 kb 兩條特異性條帶，見(jiàn)圖2;pLKO.1-puro 骨架經(jīng)凝膠回收后電泳可見(jiàn)7 kb 目的條帶，見(jiàn)圖3。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI 單酶切后可見(jiàn)1 條約7 kb 大小的目的條帶，見(jiàn)圖4;pLKO.1-HDAC2-shRNA 通過(guò)XhoI 單酶切可見(jiàn)6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 條目的片段，見(jiàn)圖5;提示外源序列插入成功。

圖1 HDAC2-shRNA 寡核苷酸退火產(chǎn)物Fig.1 Mapping of HDAC2-shRNA oligonucleotide annealed product

圖2 慢病毒載體pLKO.1-puro AgeI與EcoRI 單雙酶切鑒定圖Fig.2 Enzyme digestion and identification of lentiviral vector pLKO.1-puro by AgeI and EcoRI

圖3 pLKO.1-puro 凝膠回收大片段電泳圖Fig.3 Recovered large fragment of pLKO.1-puro by gel electrophoresis

圖4 重組慢病毒載體pLKO.1-HDAC2-shRNA的EcoRI 酶切鑒定圖Fig.4 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by EcoRI

2.3 重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測(cè)序鑒定

重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 軟件分析，基因HDAC2-shRNA 已成功克隆入慢病毒干擾載體pLKO.1 中，原始序列與已知序列的BLAST 結(jié)果完全一致，證實(shí)設(shè)計(jì)序列正確插入載體且無(wú)突變(見(jiàn)圖6)，表明合成的3 對(duì)干擾靶點(diǎn)和陰性對(duì)照均已成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒，符合預(yù)期設(shè)計(jì)。

圖5 重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA的XhoI 酶切鑒定圖Fig.5 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by XhoI

圖6 重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測(cè)序鑒定結(jié)果Fig.6 DNA sequence of pLKO.1-HDAC2-shRNA recombinant plasmid

3 討論

HDAC 是維持組蛋白乙酰化水平的關(guān)鍵酶之一，組蛋白的去乙?；饔门c基因轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)，涉及基因沉默的諸多過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中HDAC 起著重要作用［3］，HDAC 通過(guò)組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等其他蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。正常情況下，機(jī)體內(nèi)組蛋白的乙?；腿ヒ阴；幱趧?dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這種平衡的打破將成為癌癥產(chǎn)生的直接誘因［3］。組蛋白乙酰化由HDAC 和HATs 兩個(gè)家族的酶共同調(diào)控，當(dāng)HDAC 過(guò)表達(dá)或HATs 減少時(shí)，在腫瘤細(xì)胞中組蛋白大多呈低乙酰化狀態(tài)，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)異常［4-5］。HDAC2 屬于Ⅰ類HDAC，是腫瘤的治療過(guò)程中的一個(gè)重要的潛在目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2 可通過(guò)多種機(jī)制達(dá)到促癌作用，而HDAC2 的敲除可導(dǎo)致某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡［6-8］。

RNAi 技術(shù)是將內(nèi)源或外源雙鏈RNA 與細(xì)胞內(nèi)的同源序列mRNA 相結(jié)合并使之降解的技術(shù)，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)，是目前基因功能及基因治療方面的研究熱點(diǎn)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，短發(fā)夾shRNA 能夠增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并能有效敲減目的基因的表達(dá)［10］。RNAi 的作用機(jī)制是雙鏈RNA 被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生小片段的干擾RNA，這些干擾RNA 能與同源的靶RNA 互補(bǔ)結(jié)合，使靶RNA 降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)受到抑制。該方法具有效應(yīng)強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定和遺傳好等優(yōu)點(diǎn)，RNAi 研究方法的出現(xiàn)，被廣泛應(yīng)用于基因功能分析等，應(yīng)用RNAi 技術(shù)沉默靶基因的表達(dá)，有助于進(jìn)行靶基因功能以及靶基因下游相關(guān)基因等研究［2］。本實(shí)驗(yàn)選擇慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體pLKO.1-puro，構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA 的真核表達(dá)載體，此載體含有U6 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)poly(T)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在U6 啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA，從而折疊形成特異性的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)(shRNA)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA，發(fā)揮長(zhǎng)期的RNA 干擾效應(yīng)。該質(zhì)粒載體含有Amp抗性基因以便篩選克隆菌株，使其能夠在含有Amp 的LB 培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增獲取重組質(zhì)粒;在載體結(jié)構(gòu)上存在嘌呤霉素抗性基因，在進(jìn)行慢病毒感染篩選時(shí)，以獲得帶有目的基因的穩(wěn)定細(xì)胞株。

在本研究中，首先設(shè)計(jì)針對(duì)HDAC2 靶點(diǎn)特異性的寡核苷酸序列，采用基因重組技術(shù)將shRNA序列插入線性化的慢病毒表達(dá)載體pLKO.1-puro中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序驗(yàn)證均證明插入序列完全符合預(yù)期結(jié)果，沒(méi)有堿基缺失或替換，成功構(gòu)建了3 條pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質(zhì)粒載體和一條陰性對(duì)照載體，為后續(xù)HDAC2 基因的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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