張吉梅，羅 鵬*，馮紅超

(1.貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，貴州 貴陽 550004;2.貴陽市口腔醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

非綜合性唇腭裂(NSCL/P)是由于胚胎發(fā)育至6 ～12 周時，某些外界環(huán)境和遺傳因素影響面突、腭突的外胚間質細胞，使腭突、面突的生長減慢甚至停止，導致面突、腭突聯(lián)合和融合障礙，進而形成面部腭部裂隙，是口腔頜面部最常見的發(fā)育畸形之一，也是最嚴重的出生缺陷之一。近年來各國報道的唇腭裂發(fā)病率有上升的趨勢，我國的發(fā)病率達1.82‰，個別省份可高達3.07‰［1］。在2006 年的一項時間跨度為80 年(1992－2002 年)的回顧性分析中報道，中國地區(qū)唇腭裂的發(fā)病率為1.46‰，亞洲地區(qū)的總發(fā)病率為1.56‰［2］。周翠萍［3］對貴陽市15 962 例圍產兒出生缺陷結果分析發(fā)現(xiàn)，唇腭裂的構成比為7.83%。由此可以看出，唇腭裂的發(fā)病率在不同的年代，不同的地區(qū)均有不同。先天性唇腭裂常分為綜合征性唇腭裂和非綜合性唇腭裂，目前，已經了解到綜合征性唇腭裂的病因是由于染色體異常和單基因突變導致的，但是非綜合征性唇腭裂的病因和致病機制仍然沒有得出結論。本研究通過免疫組織化學法，檢測IRF6、RARA 在唇腭裂裂緣組織和正常組織中的表達，探討與NSCL/P 發(fā)生的關系，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集

選擇2013 年6 月～2014 年12 月貴州地區(qū)非綜合性唇腭裂患者唇腭裂裂緣的皮膚組織35 例作為病例組，年齡2 個月～12 歲，無其他畸形，排除綜合性唇腭裂(NSO)，所有標本均是唇腭裂修復術患者的層，肌層和黏膜層大小約1.5 mm×2 mm。15 例貴州地區(qū)因口唇外傷，口唇部囊腫等行手術治療的正常兒童唇部皮膚組織作為對照組，無先天性疾病史及唇腭裂史，年齡7 個月～15 歲，取1.5 mm×2 mm 大小唇部皮膚。

1.2 IRF6 和RARA 蛋白的測定

采用免疫組織化學法檢測IRF6 和RARA 蛋白的表達，方法如下。嚴格按照試劑盒說明說進行染色。用10%甲醛液固定標本，石蠟包埋，作連續(xù)5 μm 切片標本，行HE 和免疫組化染色。組織切片脫蠟和水化，60 ℃45 min，用二甲苯I、II 各洗泡30 min 進行脫蠟;梯度酒精浸泡，PBS 緩沖液沖洗3 次，3 min/次。將脫蠟水化后的切片放在耐高溫染色架上，放入檸檬酸緩沖液中，加熱至高壓鍋噴氣后3 min 后取出，室溫冷卻20 min，雙蒸水沖洗3次，3 min/次。每張切片滴加1 滴3%的雙氧水，烤箱中37 ℃孵育20 min 封閉內源性過氧化氫酶。滴加一抗，4 ℃恒溫冰箱中過夜，恢復至室溫，37 ℃溫箱孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片。采用半定量的記錄方法，400 倍光學顯微鏡下隨機觀察10 個視野，每個視野計數(shù)100 個細胞，計算陽性細胞所占比例，無陽性細胞為陰性(－)，陽性細胞比例=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)，其中25%為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學處理

SPSS 17.0 軟件錄入數(shù)據(jù)和分析。用χ2檢驗做單因素分析，變量進行Logistic 回歸分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理學觀察

HE 染色是顯示實驗組和對照組細胞核內染色質，細胞質內核糖體顯紫藍色，病例組顏色稍深，基底細胞層和表皮細胞層呈現(xiàn)紅色，較正常對照組的顏色稍深。未發(fā)現(xiàn)病理變化。見圖1。

2.2 IRF6 的表達

IRF6 在病例組和正常對照組中均有表達，表達部位主要在皮膚的基底細胞層，但是也有少部分在真皮成纖維細胞內表達，陽性細胞胞漿為棕色。正常對照組IRF6 的陽性表達明顯低于病例組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表1、圖2。

表1 病例組和對照組IRF6 表達Tab.1 IRF6 expression in case group and control group

2.3 RARA 的表達

RARA 在病例組的表達主要在表皮的基底層細胞、真皮附屬器的上皮細胞、基底層細胞、表皮細胞、真皮深層的成纖維細胞胞漿和細胞表面，呈棕色，陽性細胞胞漿為棕色。對照組的皮膚黏膜呈現(xiàn)弱陽性表達，與病例組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2 和圖3。

表2 病例組和對照組RARA 表達Tab.2 RARA expression in case group and control group

3 討論

圖1 兩組唇部組織的病理圖片(HE，×400)Fig.1 Pathological observation of lip tissue in two groups

圖2 IRF6 在病例組和對照組中的表達(400×)Fig.2 IRF6 expression in case group and control group

圖3 RARA 在病例組和正常對照組中的表達(400×)Fig.3 RARA expression in case group and control group

目前，對NSCL/P 的病因和致病機制仍然沒有得出結論。在遺傳學領域，NSCL/P 被認為是一種復雜的多基因遺傳性疾病，其發(fā)病機制尚未明確，但普遍認為該病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的，遺傳因素起到主要作用。人類胚胎的唇腭部發(fā)育主要在胚胎第3 ～8 周完成，所以環(huán)境因素通過母體作用于胚胎產生唇腭裂的關鍵時期就在胚胎的第3 ～8 周［4］。唇腭裂的基因定位及相關研究是目前國內外學者研究的熱點和難點，實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)，與NSCL/P 發(fā)生有關的基因有TGFα、TGFβ1、TGFβ3、MSX1、MSX2、BCL3、EDN1、RARA、MTHFR、IRF 6 和TGFA 等［5］，其中，IRF6在雙側腭突的接觸期及融合期發(fā)揮重要的調節(jié)作用［6］。尹海燕等［7］發(fā)現(xiàn)，過量維甲酸改變了昆明小鼠的胚胎神經管中RARA 基因的正常時間表達模式，這種異?？赡苁蔷S甲酸致小鼠胚胎畸形的發(fā)生機制。IRF6 在口腔頜面部、生殖器官、牙蕾等處有較高水平的表達，是口腔頜面部發(fā)育的關鍵因子。國內外的研究成果表明，IRF6 基因突變與NSCL/P 的發(fā)病有著密切的關系，任紅旺等［8］選取中國寧夏人群NSCL/P 患者進行研究，探討IRF6基因rs642961 位點與NSCL/P 的相關性，發(fā)現(xiàn)唇裂組、唇腭裂組rs642961 的AA 基因型頻率高于對照組，且A 等位基因存在過傳遞;楊明等［5］以新疆維、漢兩民族各50 例NSCL/P 患者為研究對象，探討IRF6 基因rs2013162 位點單核苷酸多態(tài)性在兩民族內和民族間基因型和等位基因型的頻率差異，發(fā)現(xiàn)rs2013162 位點GG 基因型和等位基因G 和T頻率在NSCL/P 組和對照組中分布有差異，兩民族間比較，維吾爾族GG 和TT 基因型和等位基因G的頻率均高于漢族，證明新疆維、漢族NSCL/P 與rs2013162 位點GG 基因型及等位基因G 存在相關性;此外，還有研究證明IRF6 基因的rs4844880、rs2235375、rs7545538、rs7545542、等位點與NSCL/P 的發(fā)生相關聯(lián)［9－11］。本研究通過免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)，IRF6 在NSCL/P 裂緣組織中和正常黏膜組織中均有表達，表達部位主要在皮膚的基底細胞層，有少部分在真皮成纖維細胞內表達，正常黏膜組織中的表達較在NSCL/P 組織中弱且少，表皮的真皮附屬器的上皮細胞、基底層細胞、細胞表面、真皮深層的成纖維細胞胞漿都呈現(xiàn)弱表達。RARA 基因分布在全身各種組織中，結合蛋白RAR-α、RAR-β、RAR-γ 參與視黃酸的體內運輸和代謝過程，因此視黃類的致畸性主要由RARA 介導［12］。復合的RARA 基因無義突變可導致機體多處畸變，像頭部、肢體及眼部缺陷等。尹海燕等［7］以維甲酸致昆明小鼠腭裂動物模型為基礎，采用免疫組化法檢測RARA 蛋白在顎板組織中的表達，研究發(fā)現(xiàn)，在過量維甲酸致昆明小鼠腭裂發(fā)生過程中，RARA 的表達被下調。本實驗研究發(fā)現(xiàn)RARA主要在表皮的基底層細胞、真皮附屬器的上皮細胞、基底層細胞、表皮細胞、真皮深層的成纖維細胞胞漿和細胞表面呈現(xiàn)棕色的陽性表達，在正常組的皮膚黏膜內則呈現(xiàn)弱陽性表達，在NSCL/P 裂緣組織中和正常黏膜組織比較有差異。綜上所述，IRF6和RARA 在唇腭裂裂緣組織中的表達增高，可能與NSCL/P 的發(fā)生有關。

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