孫 嘉，馬 丹，王 萍，方 琴

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液科，貴州 貴陽 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 藥劑科，貴州貴陽 550014)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是目前一種仍不能治愈的以漿細(xì)胞惡性增殖為特征的疾?。?］，臨床上多采用環(huán)磷酰胺、沙利度胺等藥物誘導(dǎo)化療［2－3］。白樺脂酸(betulinic acid，BA)是從白樺樹樹皮中提取的一種天然化合物，有抑菌、調(diào)血脂及抗瘧疾等藥理活性［4－5］。研究表明，白樺脂酸作用于腦瘤、骨髓瘤等惡性淋巴腫瘤細(xì)胞后，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用［6］。近年來，開發(fā)毒副作用低、能長(zhǎng)期性和西藥合用治療MM 中藥已成為研究的新熱點(diǎn)［7］。本課題主要以MM 為切入點(diǎn)，以MM 的U266 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺促進(jìn)U266 細(xì)胞凋亡及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人MMU266 細(xì)胞房獲贈(zèng)于湘雅醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血科。白樺脂酸購自Alexis 公司，沙利度胺購自美國(guó)Sigma life secience 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco 公司，β-actin、Survivin、Bcl-2、Bax、Cyto-c 單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT 購自美國(guó)AxyPrep 公司，Prime-ScriptTMRT reagent KIT 購自日本TaKaRa 公司，SYBR Premix Ex TapTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U266 細(xì)胞接種于含15%的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 試劑溶液的配制 用電子天平精密分別稱取白樺脂酸和沙利度胺，分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成5 g/L 原液，分裝備用，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別用含血清RPMI-1640 培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋即得各給藥濃度。

1.2.3 U266 細(xì)胞增殖抑制率 U266 細(xì)胞株按5×103個(gè)/孔接種于96/板，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，用白樺脂酸(20、40、60 和80 mg/L)、沙利度胺(10、50 和100 mg/L)及白樺脂酸(40 mg/L)聯(lián)合沙利度胺(10、50 和100 mg/L)分別處理，分別為白樺脂酸組、沙利度胺組和聯(lián)合組，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不做任何處理)，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)適宜時(shí)間(白樺脂酸組24、48 和72 h，沙利度胺組和聯(lián)合組48 h)，然后每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO150 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，并用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A 值－實(shí)驗(yàn)組A 值)/對(duì)照組A 值×100%。根據(jù)增殖抑制率和濃度計(jì)算出IC50值，IC50=lg－1［Xm－i(ΣP－0.5)］，求得最適濃度。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U266 細(xì)胞4×104/mL，接種于6 孔板，每孔接種量2.5 mL，分別用沙利度胺(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)或與白樺脂酸聯(lián)合處理48 h，用PBS 洗滌細(xì)胞1 次，1 500 r/min 離心5min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106，制備的單細(xì)胞懸液用70%乙醇固定，4 ℃保存;染色前用PBS 洗去固定液，加RNase A100 μL 于37 ℃水浴30 min。加入PI 染色液400 μL 混勻，4 ℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)U266 細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 U266 中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA檢測(cè) 分別取對(duì)照組、白樺脂酸(40 mg/L)、沙利度胺(50 mg/L)以及聯(lián)合組(40 mg/L 白樺脂酸聯(lián)合50mg/L 沙利度胺)U266 細(xì)胞，用AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT 試劑盒提取細(xì)胞總RNA;按PrimeScriptTMRT reagent KIT 和SYBR Premix Ex TapTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明書分別進(jìn)行cDNA 的合成和RT-PCR 反應(yīng)。Survivin上游引物5'-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3'，下游引物5'-AGCCACTCCCCCACAGC A-3'。Bcl-2 上游引物5'-TGTGCCTGTAAACATAGATTGGC-3，下游引物5'-CTTCCAGACATCGCACACCA-3'。Bax 上游引物5'-CCAAGAAGAAGCTGAGCGAGTCTC-3'，下游引物5'-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3'。Cyto-C 上游引物5'-GCCCGGAACGAATTAAAAAT-3'，下游引物5'-TGCCTCCCTTTTCCACAGT-3'。β-actin 上游引物5'-GACAAGGGCTCCGGCATGTG-3，下游引物5'-TGAGGATGCCTCTCTTGCTC-3'。

1.2.6 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白檢測(cè) 分別取對(duì)照組、白樺脂酸(40 mg/L)組、沙利度胺(50 mg/L)及聯(lián)合組(40 mg/L 白樺脂酸聯(lián)合50 mg/L沙利度胺)U266 細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液的樣本冰上孵育30 min，超聲粉碎儀進(jìn)行超聲粉碎。4 ℃12 000 r/min 離心20 min，取少量以Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg 蛋白經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，PVDF 膜經(jīng)封閉液室溫封阻1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)蛋白表達(dá)。β-actin 作為內(nèi)參，Western blotting 檢測(cè)Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白樺脂酸對(duì)U266 細(xì)胞的增殖抑制率的影響

U266 細(xì)胞經(jīng)白樺脂酸處理24、48 和72 h 后，在相同時(shí)間下，隨著作用濃度的增加，白樺脂酸U266 細(xì)胞增殖抑制率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);白樺脂酸對(duì)U266 細(xì)胞的IC50值24、48、72 h 分別為((76.27±1.83)mg/L、(42.81±2.18)mg/L、(29.64±2.53)mg/L。根據(jù)IC50得出，白樺脂酸作用于多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞最適濃度為40 mg/L。見圖1。

2.2 沙利度胺組與聯(lián)合組對(duì)U266 細(xì)胞增殖抑制率的影響

圖1 不同濃度白樺脂酸對(duì)U266 細(xì)胞增殖抑制率的影響(MTT)Fig.1 The effect of BA at different concentrations on proliferation inhibition rate of U266 cells

與沙利度胺組相比，聯(lián)合組U266 細(xì)胞的增殖抑制率明顯升高(P ＜0.05);隨著沙利度胺濃度增加，兩組U266 細(xì)胞的增殖抑制率均明顯升高(P ＜0.05);沙利度胺組和聯(lián)合組的IC50值分別為(52.02±2.34)mg/L、(26.19±3.21)mg/L，聯(lián)合白樺脂酸用藥可以明顯抑制U266 細(xì)胞的增殖(P ＜0.05)。根據(jù)IC50值得出，沙利度胺作用U266細(xì)胞最適濃度為50 mg/L。見圖2。

圖2 沙利度胺組與聯(lián)合組中U266 細(xì)胞增殖抑制率(MTT)Fig.2 The effects of halidomide single or combined with betulinic acid on proliferation inhibition rate of U266 cells

2.3 沙利度胺組與聯(lián)合組對(duì)U266 細(xì)胞凋亡的影響

用沙利度胺、沙利度胺聯(lián)合白樺脂酸分別處理U266 細(xì)胞48 h，與沙利度胺組比較，聯(lián)合組U266細(xì)胞的凋亡率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

2.4 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA 的表達(dá)

與沙利度胺組或白樺脂酸組相比，聯(lián)合組U266 細(xì)胞中Survivin、Bcl-2 mRNA 的表達(dá)明顯降低，Cyto-C 和Bax mRNA 表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖3。

表1 沙利度胺組與聯(lián)合組U266 細(xì)胞的凋亡率(%)Tab.1 The apoptosis rate of U266 cells in thalidomide group and combination group

圖3 4 組U266 細(xì)胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA 的表達(dá)Fig.3 Expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA of U266 cells in the 4 groups

2.5 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白質(zhì)水平

與沙利度胺、白樺脂酸組相比，聯(lián)合組U266細(xì)胞中Survivin、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低，Cyto-C和Bax 蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖4。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是骨髓漿細(xì)胞惡性疾病，主要以骨髓中漿細(xì)胞惡性增殖并引起相關(guān)器官或組織損害為表現(xiàn)［8］。多發(fā)性骨髓瘤患者一般常常伴有高鈣血癥，貧血，腎功能嚴(yán)重?fù)p傷等多種并發(fā)癥，由于多發(fā)性骨髓瘤能抑制人體正常免疫球蛋白的增殖而導(dǎo)致各種細(xì)菌性感染頻發(fā)［9］。臨床研究表明，臨床治療多發(fā)性骨髓瘤得化療方案多以硼替佐米或來那度胺聯(lián)合馬法蘭等藥物治療［10－13］，但化療存在藥物耐受性差、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)而不能達(dá)到很好的治療效果。目前，多發(fā)性骨髓瘤仍難治、易復(fù)發(fā)［14－17］。

本實(shí)驗(yàn)探討白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺是否可以促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞凋亡，采用不同濃度的白樺脂酸處理多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞，白樺脂酸可以抑制U266 細(xì)胞的增殖，并隨著白樺脂酸濃度的升高，增殖抑制率升高，說明白樺脂酸在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用，白樺脂酸可以促進(jìn)U266 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使多發(fā)性骨髓瘤疾病有所改善。本實(shí)驗(yàn)還將白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺共同作用于多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率，與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥可明顯抑制U266 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，提示白樺脂酸與沙利度胺聯(lián)合用藥可用于治療多發(fā)性骨髓瘤可以起到一定效果，可以成為今后臨床研究的一個(gè)新靶點(diǎn)。

凋亡的調(diào)控是細(xì)胞生理死亡和腫瘤發(fā)生的重要的發(fā)生機(jī)制，一些凋亡調(diào)控因子在多發(fā)性骨髓瘤疾病中發(fā)揮了重要作用。本研究檢測(cè)U266 細(xì)胞中凋亡家族相關(guān)基因和蛋白，發(fā)現(xiàn)如果白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺共同處理多發(fā)性骨髓瘤U266 細(xì)胞之后，Survivin、Bcl-2 的表達(dá)與單獨(dú)用白樺脂酸或沙利度胺顯著降低，白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺可明顯下調(diào)Survivin、Bcl-2 表達(dá)，而激活Cyto-c、Bax 表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為多發(fā)性骨髓瘤的臨床研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，白樺脂酸聯(lián)合沙利度胺用藥可以抑制骨髓瘤U266 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡，聯(lián)合用藥可能成為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的信策略。然而，在未來的研究中，我們將需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以探討聯(lián)合應(yīng)用白樺脂酸的有效性和對(duì)多發(fā)性骨髓瘤治療的作用機(jī)制。

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圖4 4 組U266 細(xì)胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA of U266 cells in the 4 groups

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