陸 苑，謝玉敏，潘 潔，黃 勇，王永林＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學 藥學院 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004)

隨著代謝性藥物相互作用引起的不良反應案例逐年增多，對于藥物間的相互作用的有效預測就顯得尤為必要。研究表明，導致藥物代謝性相互作用的主要原因是CYP450 酶系被抑制或被誘導，其中酶抑制作用所致藥物相互作用的臨床意義遠大于酶誘導作用，約占代謝性藥物相互作用的70%。酶抑制作用的研究最常使用的模型就是肝微粒體［1－4］。因此，本文建立選用甲苯磺丁脲(CYP2C9)、氯唑沙宗(CYP2E1)、咪達唑侖和睪酮(CYP3A4)、奧美拉唑(CYP2C19)和對乙酰氨基酚(CYP2A1)的作為探針底物，以其各自專一性代謝產(chǎn)物作為UPLC-MS/MS 檢測對象來評價5 種CYP450 酶的活性，并通過方法學驗證，為體外快速預測潛在的藥物相互作用提供參考。

1 實驗儀器與材料

超高效液相色譜系統(tǒng)(ACQUITY UPLC，美國沃特世公司，Allegra 64R 低溫高速離心機(美國Beckman Coulter 公司)，700 系列超低溫冰箱(美國Thermo 公司)。非那西丁(批號81105)、奧美拉唑(批號90925)、甲苯磺丁脲(批號20321)、睪酮(批號10519)、磺胺苯吡唑(批號01022)和酮康唑(批號11205)均購于德國Dr 公司，咪達唑侖注射液(批號20120903)購于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，氯唑沙宗(批號100364－200301)、對乙酰氨基酚(批號100018－200408)和氟康唑(批號100314－201204)購于中國食品藥品檢定研究院，羥基甲苯磺丁脲(批號1－PSB－27－2)、5 羥基奧美拉唑(批號1－PSB－27－2)、6-羥基氯唑沙宗(批號6－QFY－28－2)和6β-羥基睪酮(批號KIT0635)購于加拿大TRC 公司，α-羥基咪達唑侖(批號FN101512－07)購于美國Cerilliant 公司，氯美噻唑(批號4300－133)fluorochem，α-萘黃酮(批號AO222928)購于ACROS ORGANICS，人肝微粒體購于美國BD 公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 體外代謝實驗

采用NADPH 再生系統(tǒng)，終體積為200 μL 的體外孵育體系包括含肝微粒體蛋白0.5 g/L、NADP+20 g/L、六磷酸葡萄糖20 g/L、MgCl213.3 g/L 及六磷酸葡萄糖脫氫酶40 U/mL，甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、咪達唑侖、睪酮、奧美拉唑和非那西丁在溶液中的濃度分別為100、100、50、200、50 和50 μmol/L，其余為pH7.4 的0.1 mol/L PBS 緩沖溶液。37 ℃預孵3 min，加入底物開始反應。每次加入反應體系中有機試劑終濃度不超過1% (v/v)。反應完畢后加入100 μL 甲醇終止反應，再加入2 mg/L 葛根素溶液100 μL，渦混，超聲3 min，15 000 r/min離心10 min，取上清液1 μL 供UPLC-MS/MS 分析。

2.2 分析條件

2.2.1 液相條件 色譜柱Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱，流速0.35 mL/min，柱溫45 ℃，流動相0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，檢測6 種專一性代謝產(chǎn)物的梯度條件0 ～3.0 min 5%～65%A，3.0 ～3.5 min 65%～90%A，3.5～4.5 min 10%A;進樣體積1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI);毛細管電壓3 kV，離子源溫度120 ℃去溶劑氣溫度350 ℃;去溶劑氣N2，流速650 L/h;反吹氣N2，流速50 L/h;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1 工作站，掃描方式為多反應離子監(jiān)測模式(MRM)。離子對質(zhì)譜條件見表1。

表1 離子對質(zhì)譜條件Tab.1 Ion pair mass spectrometry

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 分別取6 份人肝微粒體孵育液，除不加探針藥物和內(nèi)標外，其余按“2.1”項操作，獲得空白樣品色譜圖1－A;將一定濃度標準溶液和內(nèi)標溶液加入滅活的人肝微粒體孵育液(置于沸水浴中10 min)，同法得色譜圖1－B;各探針藥物在人肝微粒體孵育液中孵育60 min，同法得色譜圖1－C。結(jié)果見圖1，對乙酰氨基酚、內(nèi)標葛根素、6-羥基氯唑沙宗、5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲、6β-羥基睪酮和α-羥基咪達唑侖的相對保留時間(RT)分別為0.75、1.00、1.23、1.34、1.79、1.84和1.91 min。結(jié)果表明，空白肝微粒體無干擾，專屬性良好。

圖1 人肝微粒體孵育液體系色譜圖Fig.1 Chromatographic chart of incubation fluid system of human liver microsomes

2.3.2 標準曲線的制備和最低檢測限 將人肝微粒體滅活后，按“2.1”項下操作，加入含有6 種代謝產(chǎn)物的混合標準溶液。以待測物的峰面積與內(nèi)標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y，各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標X 用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求得標準曲線。6 種探針藥物的代謝產(chǎn)物的最低檢測限(LLOD)定義為S/N≥3，各成分相關(guān)系數(shù)(R2)＞0.996。見表2，在相應范圍內(nèi)，6 種代謝物的線性關(guān)系良好。

表2 6 種代謝產(chǎn)物回歸曲線方程Tab.2 Regression curve equation for 6 metabolites

2.3.3 準確度和精密度 按“2.3.2”項下分別配制低、中、高3 個濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每個濃度平行6 份(n=6)，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日標準曲線計算QC 樣品的濃度，評價方法的準確度與日內(nèi)、日間精密度。見表3。該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好。

表3 檢測物的的準確度、日內(nèi)和日間精密度()Tab.3 Accuracy and precision of the detection

表3 檢測物的的準確度、日內(nèi)和日間精密度()Tab.3 Accuracy and precision of the detection

檢測物Q(C μ 樣m品ol/濃L)度 準確度(%)密日(度內(nèi)%R精)S D日度(間%R精S)D密對乙酰氨基酚0.52 97.11±13.70 8.0 8.4 2.09 97.75±3.20 6.9 5.5 8.35 101.38±4.98 4.6 3.5 6-羥基氯唑沙宗 6.04 99.27±5.52 8.0 6.3 24.16 101.41±2.87 7.7 3.6 96.63 99.63±2.71 3.9 3.7 5-羥基奧美拉唑 0.19 102.61±15.95 8.0 8.5 0.77 95.96±2.28 6.5 5.5 3.09 98.25±11.47 4.6 3.5羥基甲苯磺丁脲 0.3 101.84±15.38 5.1 5.4 1.22 99.39±7.93 5.4 1.5 4.88 100.83±6.91 4.6 3.5 6β-羥基睪酮 7.34 98.82±5.63 5.0 5.3 29.34 102.29±2.95 7.7 3.6 117.37 101.45±0.29 5.4 5.7 α-羥基咪達唑侖 3.27 102.53±13.59 12.7 8.4 13.09 103.10±8.49 8.4 7.5 52.37 102.79±2.07 7.6 4.9

2.3.4 提取回收率和基質(zhì)效應 按“2.3.2”項下操作，分別配制低、中、高3 個濃度的QC 樣品，每個濃度平行操作5 份，按“2.1”項下操作(A 樣品)。另取空白人肝微粒體孵育體系，除不加混合標準溶液與內(nèi)標外，其余按“2.1”項下操作，向獲得的上清液中加入相應低、中、高濃度的混合標準溶液和內(nèi)標(B 樣品);另取上述低、中、高濃度的混合標準溶液與內(nèi)標，以初始流動相溶解(C 樣品)。內(nèi)標以同樣方法進行考察。提取回收率計算方法為B 樣品與A 樣品色譜峰面積之比，基質(zhì)效應計算方法為B 樣品與C 樣品的色譜峰面積之比。6 種代謝物的提取回收率和基質(zhì)效應結(jié)果結(jié)果見表4，內(nèi)標的提取回收率和基質(zhì)效應分別為98.6%和94.8%。實驗結(jié)果表明各指標成分提取回收率良好，無明顯的基質(zhì)效應。

表4 檢測物的提取回收率和基質(zhì)效應(，n=6)Tab.4 Extraction recovery and matrix effect of the detection

表4 檢測物的提取回收率和基質(zhì)效應(，n=6)Tab.4 Extraction recovery and matrix effect of the detection

檢測物Q(C μ 樣m o品l濃/L)度提率取(回%收)(R%S D)基(質(zhì)%效)應(R%S D)對乙酰氨0.52 87.3±2.3 2.6 90.8±4.9 5.4基酚2 8..0 3 9 5 9 9 6 7..2 8±±1 0..6 9 1 0..6 9 9 9 1 4..7 7±±4 5..1 9 4 6..5 3 6-羥 基 氯6.04 86.7±3.5 4.0 94.1±6.3 6.7唑沙宗2 9 4 6..1 6 6 3 1 8 0 8 4..8 3±±0 5..9 5 1 5..0 3 9 8 4 5..2 1±±8 4..1 2 8 4..6 9 5-羥 基 奧0.19 88.6±0.9 1.0 92.2±4.7 5.1美拉唑0 3..7 0 7 9 9 9 2 4..7 6±±7 4..1 5 7 4..6 8 8 9 7 6..7 9±±0 2..2 1 0 2..2 2羥基甲苯0.3 94.0±5.6 5.9 99.1±10.5 10.6磺丁脲1 4..2 8 2 8 1 9 0 1 2..3 7±±5 2..6 4 6 2..1 3 10 9 2 6..7 2±±6 9..9 9 1 6 0..7 2 6β-羥基睪7.34 98.6±1.1 1.1 98.6±4.1 4.2酮1 2 1 9 7..3 3 4 7 1 9 0 6 3..1 0±±1 6 0..6 0 1 6 0..4 4 9 9 5 2..8 1±±5 4..3 2 5 4..6 6 α-羥 基 咪3.27 76.1±4.3 5.6 98.3±7.7 7.8達唑侖1 5 3 2..0 3 9 7 8 9 3 8..2 4±±3 0..2 8 3 0..8 8 9 9 4 9..3 8±±8 0..5 6 9 0..0 6

2.3.5 穩(wěn)定性考察 按“2.3.2”項下分別配制低、中、高3 個濃度的QC 樣品，每一濃度5 個樣本分析，置于自動進樣器中0、6 h，室溫(約20 ℃)下放置6 h，4 ℃下冷藏8 h，凍融循環(huán)3 次。人肝微粒體孵育樣品中6 種專一性代謝產(chǎn)物的在上述放置條件下穩(wěn)定。

2.3.6 質(zhì)量控制實驗 在每批測定時隨行測定低、中、高3 個濃度的QC 樣品，每個濃度的QC 樣品進行雙樣本分析，測定數(shù)不少于樣本總量的5%。結(jié)果3 個批次實驗的QC 樣品中、高濃度的回收率為85%～115%，低濃度的回收率為80%～120%，符合生物樣品分析方法的檢測要求。

2.4 陽性抑制劑對CYP450 酶活性的影響

參照FDA 指南，選擇5 種特異性抑制劑磺胺苯吡唑(CYP2C9)、氯美噻唑(CYP2E1)、酮康唑(CYP3A4)、氟 康 唑(CYP2C19)、α-萘 黃 酮(CYP2A1)，分別取0、0.01、0.05、0.1、0.3、1.0、3.0 以及10.0 μmol/L8 種不同濃度加入到Cocktail探針底物反應體系中。按“2.1”項下操作，孵育和進樣分析，測定生成的專一性代謝產(chǎn)物。采用GraphPad 5.0 軟件進行非線性擬合，各抑制劑的IC50值在文獻報導值的3 倍以內(nèi)［3］，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著陽性抑制劑濃度的增加，酶活性逐漸降低。根據(jù)文獻［4－12］，可知磺胺苯吡唑?qū)YP2C9 的IC50值為0.2 ～1.52 μmol/L，氯美噻唑?qū)YP2E1 的IC50值為12 μmol/L，酮康唑?qū)YP3A4(咪達唑侖)的IC50值為0.008 ～1.8 μmol/L，酮康唑?qū)YP3A4(睪酮)的IC50值為2 ～23.8 μmol/L，α-萘黃酮對CYP1A2 的IC50值為0.04 ～0.2 μmol/L。見表5 和圖2。

表5 特異性抑制劑的半數(shù)抑制濃度Tab.5 Median inhibitory concentrations of specific inhibitors

3 討論

采用人混合肝微粒體作為研究對象，可降低個體和種屬差異造成的影響，具有實際指導意義。本研究采用UPLC-MS/MS 儀器建立Cocktail 混合探針，可對藥物的6 種代謝物起到靈敏、特異、可靠、超快速定量分析的方法，顯著提高了定量分析的重復性、可靠性、準確性［13］。采用甲醇沉淀肝微粒體蛋白，高速離心凈化樣品，較常規(guī)的固相萃取法和有機溶劑萃取法可更經(jīng)濟、快速地滿足高通量篩選的要求，以滿足體外快速篩選藥物相互作用。由于CYP3A4 具有底物依賴性，一般認為CYP3A4 潛在抑制能力評價的謹慎方法是使用多種探針來測定(至少兩種探針底物)，因此本研究選用了最常使用的咪達唑侖和睪酮［4］。

圖2 特異性抑制劑對人肝微粒體細胞色素P450 酶5 種亞型的抑制曲線Fig.2 Inhibition curves of 5 subtypes of cytochrome P450 in human liver microsomes with specific inhibitors

因此，本方法既然可作為新藥候選化合物的篩選工具，又可評價已上市藥物及預測臨床聯(lián)合用藥產(chǎn)生的藥物相互作用;另外，還可評價中藥提取物、單方或復方中成藥、中藥配伍對CYP450 的影響［14］，預測潛在的藥物相互作用，降低患者的用藥風險，保障臨床安全用藥。

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