張趁華，蔡家利

（1莆田學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 莆田351100；2重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶400054）

單克隆抗體在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價(jià)值，可直接用于人類疾病的診斷、機(jī)體免疫機(jī)制的研究以及實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究等，尤其可為人類惡性腫瘤的免疫診斷提供較為可靠的輔助指標(biāo)［1－2］。

在世界范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，但肺癌的診斷技術(shù)并未十分完善，臨床上常用的X線檢查、支氣管鏡檢查、ECT檢查等不僅耗時(shí)耗力，而且確診率不高。近些年免疫檢測成為癌癥診斷的研究熱點(diǎn)。免疫組化檢測以簡易、快捷、通用、靈敏、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)在疾病免疫檢測方法中占有重要的地位。將肺癌單克隆抗體用于肺癌免疫組化檢測中，將為肺癌的診斷提供較為可靠的輔助指標(biāo)［3－4］。

目前，國內(nèi)外臨床診斷中還沒有一種針對大細(xì)胞肺癌的有效診斷試劑，常用的血清p53抗體檢測、癌胚抗原（CEA）檢測、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）檢測、細(xì)胞角蛋白片段（CYFRA21－1）檢測等，特異性均不理想，本文所制備的抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體正好能解決這一問題。其可廣泛用于臨床大細(xì)胞肺癌的檢測診斷中。

1 材料和方法

1.1 材料

弗氏不完全佐劑（Freund′s Incompleted Adjuvant，F(xiàn)IA，北京鼎國生物技術(shù)有限公司），6～8周齡Balb／C小鼠（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），羊抗鼠IgG－HRP（北京鼎國生物技術(shù)有限公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純，大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞株、小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和抗人大細(xì)胞肺癌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株（重慶理工大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存），DMEM培養(yǎng)基（GiBCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞株、小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng) 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基對大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞株、小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株和抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并在液氮中凍存數(shù)支［5－6］。

1.2.2 抗人大細(xì)胞肺癌單克隆抗體的制備和純化鑒定 用弗氏不完全佐劑免疫Balb／C小鼠，3～5 d后，腹腔注射抗人大細(xì)胞肺癌雜交瘤細(xì)胞1～5×106個(gè)／只，接種細(xì)胞10～12d后出現(xiàn)腹水，12號針頭插入腹腔引流收集小鼠腹水持續(xù)數(shù)日。收集到的腹水采用辛酸－硫酸銨法純化。純化方法如下：2 500r／min離心腹水棄雜質(zhì)，加入等體積的0.06 mol／L，pH 4.0NaAc－HAc緩沖液，調(diào)pH 至4.8；加入1／33體積的辛酸，室溫?cái)嚢琛?0min，4℃攪拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h；4℃，15 000 r／min離心30min，去除白蛋白和其他非IgG蛋白，上清加入1／10體積的10×PBS（0.01mol／L，pH 7.4），調(diào) pH 至 7.2；上清滴加等量飽和硫酸銨（pH 7.2～7.4）溶液，使硫酸銨的飽和度為50%，繼續(xù)攪拌10～30min，靜置30min；4℃，10 000r／min離心30min，棄上清，將沉淀溶于1.2mL，0.01 mol／L，pH 7.4PBS 中；4℃，0.01mol／L，pH 7.4 PBS透析過夜，其間換液3次，收集透析袋內(nèi)液體，即為純化后的腹水單抗，－20℃凍存?zhèn)溆貌⑷∩倭坑糜?SDS－PAGE分析純化純度［7－9］。

1.2.3 抗大細(xì)胞肺癌單抗對培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞的特異性檢測

（1）細(xì)胞爬片的制備：將處于對數(shù)生長期的大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的濃度分別調(diào)至3×106個(gè)／mL，將細(xì)胞懸液滴至滅菌玻片上，以鋪滿玻片為準(zhǔn)，放置5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48h后，用丙酮固定細(xì)胞爬片20min后，放置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）免疫組化法鑒定細(xì)胞爬片：采用間接免疫組化檢測法。在細(xì)胞爬片上滴加3%H2O2／甲醇溶液，室溫，10min，用于祛除細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶；封閉液1%BSA封閉細(xì)胞爬片，37℃，20min；一抗為稀釋度為1∶200的抗大細(xì)胞肺癌單抗，37℃，1 h；二抗為稀釋度為1∶400的HRP－羊抗鼠IgG，37℃，30min；顯色液DAB顯色10～30s后，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。陽性對照為大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞爬片，陰性對照為小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞爬片［10－11］。

1.2.4 抗大細(xì)胞肺癌單抗對臨床樣品的特異性檢測

（1）石蠟病理切片的預(yù)處理：大細(xì)胞肺癌石蠟病理切片和小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片均購于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。大細(xì)胞肺癌患者兩例，入院時(shí)癥狀均表現(xiàn)為咳嗽，痰中帶血，胸痛，呼吸困難，頭面部及上臂水腫，頸部淋巴結(jié)腫大，病理標(biāo)本一例為胸腔鏡檢查所獲，一例為纖維支氣管鏡檢查所獲；小細(xì)胞肺癌患者一例，入院時(shí)癥狀表現(xiàn)為咳嗽，胸悶，氣短，頭暈，吞咽困難，病理標(biāo)本為纖維支氣管鏡檢查所獲。

將石蠟病理切片放置于65℃的恒溫箱中進(jìn)行烤片，2h；二甲苯脫蠟，15min；無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇梯度脫水，每次5min；微波修復(fù)抗原后備用［12－14］。

（2）免疫組化法鑒定石蠟病理切片：采用間接免疫組化檢測法，方法同1.2.4（2）。陽性對照為大細(xì)胞肺癌石蠟病理切片，陰性對照為小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片。

2 結(jié)果

2.1 抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體純化結(jié)果

采用辛酸－硫酸銨法純化抗大細(xì)胞肺癌小鼠單抗腹水，如圖1（a為中分子量蛋白 Marker，b為未純化的腹水，c為純化后的腹水）所示，小鼠腹水中的雜蛋白已基本除去，抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體其純度可達(dá)到90%以上。

圖1 抗人大細(xì)胞肺癌單克隆抗體純化前后的SDS－PAGE分析Fig.1 The SDS－PAGE mobility pattern of lung cancer monoclonal antibody befor and after purificationa.中分子量蛋白 Marker；b.未純化的腹水；c.純化后的腹水。

2.2 抗大細(xì)胞肺癌單抗對培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞的特異性檢測結(jié)果

圖2 大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞爬片的免疫組化檢測結(jié)果（×100）Fig.2 The micrographs of the big cell lung cancer NCIH460 cell by immunohistochemistry（×100）大細(xì)胞肺癌細(xì)胞細(xì)胞核染為藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)與單抗特異性結(jié)合的抗原蛋白被染為黃色。

圖3 小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞爬片的免疫組化檢測結(jié)果（×100）Fig.3 The micrographs of the small cell lung cancer A549cell by immunohistochemistry（×100）小細(xì)胞肺癌細(xì)胞細(xì)胞核染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白均無著色。

抗大細(xì)胞肺癌單抗應(yīng)用于間接免疫組化檢測法檢測大細(xì)胞肺癌細(xì)胞爬片和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞爬片，檢測結(jié)果如圖2、圖3所示，抗大細(xì)胞肺癌單抗能特異性地識(shí)別出大細(xì)胞肺癌細(xì)胞，染色液蘇木素將細(xì)胞核染為藍(lán)色作為背景色，DAB顯色液將大細(xì)胞肺癌細(xì)胞中與抗大細(xì)胞肺癌單抗特異性結(jié)合的抗原蛋白染為黃色，能顯微鏡下清晰地辨認(rèn)；小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中除被蘇木素染為藍(lán)色的細(xì)胞核外其他則無任何顯色反應(yīng)。

2.3 抗大細(xì)胞肺癌單抗對臨床樣品的特異性檢測結(jié)果

大細(xì)胞肺癌病理切片和小細(xì)胞肺癌病理切片均購于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。其中，大細(xì)胞肺癌病理切片標(biāo)本兩例，一例來源于65周歲的男性晚期大細(xì)胞肺癌病人，取癌腫組織及癌旁2cm處組織為標(biāo)本，一例來源于71周歲的男性晚期大細(xì)胞肺癌病人，取癌腫組織及癌旁2cm處組織為標(biāo)本；小細(xì)胞肺癌病理切片標(biāo)本一例，來源于62周歲的男性晚期小細(xì)胞肺癌病人，取癌腫組織及癌旁2cm處組織為標(biāo)本。

圖4 大細(xì)胞肺癌石蠟病理切片免疫組化檢測結(jié)果（×100）Fig.4 The micrographs of the big cell lung cancer tissue by immunohistochemistry（×100）石蠟切片中細(xì)胞的細(xì)胞核均被染為藍(lán)色，只有大細(xì)胞肺癌細(xì)胞中與單抗特異性結(jié)果的抗原蛋白被染為黃色，其他細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白均無色。

圖5 小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片免疫組化檢測結(jié)果Fig.5 The micrographs of the small cell lung cancer tissue by immunohistochemistry石蠟切片中細(xì)胞的細(xì)胞核均被染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白均無色。

大細(xì)胞肺癌單抗應(yīng)用于間接免疫組化檢測法檢測大細(xì)胞肺癌石蠟病理切片和小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片，檢測結(jié)果如圖4、圖5所示，染色液蘇木素將細(xì)胞核染為藍(lán)色作為背景色，抗大細(xì)胞肺癌單抗能特異性地識(shí)別出石蠟病理切片中的大細(xì)胞肺癌細(xì)胞，DAB顯色液將大細(xì)胞肺癌細(xì)胞中與抗大細(xì)胞肺癌單抗特異性結(jié)合的抗原蛋白染為黃色，其他細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白均未著色，能在顯微鏡下清晰地辨認(rèn)；小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片中的細(xì)胞除被蘇木素染為藍(lán)色的細(xì)胞核外，其他均無任何顯色反應(yīng)。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的一種惡性腫瘤，近些年隨著生存環(huán)境的惡化、空氣污染的加劇等因素，肺癌的發(fā)病率和死亡率也在逐年升高。雖然傳統(tǒng)檢測肺癌的方法如X線檢查、支氣管鏡檢查、ECT檢查等技術(shù)也在不斷地發(fā)展中，但這些技術(shù)需要精密檢測儀器的支持和醫(yī)生常年積累的檢測和診斷經(jīng)驗(yàn)，而且確診率也不高。在過去十多年中，由于基因、免疫學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域中取得的進(jìn)展已使肺癌的確診成為可能，尤其是肺癌診斷試劑的研制使肺癌的快速、簡便、有效診斷成為可能［15－16］。

本文所制備的抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體特異性強(qiáng)、敏感度高，能選擇性地結(jié)合大細(xì)胞肺癌細(xì)胞質(zhì)的抗原蛋白，而不與其他蛋白結(jié)合。將抗大細(xì)胞肺癌單克隆抗體應(yīng)用于免疫組化檢測中，在顯微鏡下即可觀察檢測結(jié)果，方便、快捷、耗時(shí)短、重現(xiàn)性好、確診率高，無須特殊儀器設(shè)備和專業(yè)技能，為肺癌患者的診斷提供可靠的輔助性指標(biāo)，可廣泛用于臨床大細(xì)胞肺癌的檢測診斷中，具有良好的市場應(yīng)用前景［17］。

4 結(jié)論

本文制備的大細(xì)胞肺癌單克隆抗體通過小鼠腹水?dāng)U增并采用辛酸－硫酸銨法純化，純度可達(dá)到90%以上；應(yīng)用大細(xì)胞肺癌單克隆抗體對培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞和臨床樣本通過免疫組化法進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果均顯示大細(xì)胞肺癌單克隆抗體可特異性地與大細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)的抗原蛋白結(jié)合，在顯微鏡下及可觀察檢測結(jié)果，可為大細(xì)胞肺癌的診斷提供可靠的輔助性指標(biāo)。

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