楊維平，鄭行望

(1 陜西師范大學 民族教育學院，陜西 西安 710062；2 陜西師范大學 化學化工學院，陜西 西安 710119)

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毛細管柱內在線反應化學發(fā)光測定抗壞血酸

楊維平1，鄭行望2

(1 陜西師范大學 民族教育學院，陜西 西安 710062；2 陜西師范大學 化學化工學院，陜西 西安 710119)

建立了一種毛細管柱內反應毛細管區(qū)帶電泳分離化學發(fā)光檢測痕量抗壞血酸的新方法。方法基于酸性重鉻酸鉀在毛細管柱內與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應生成具有化學發(fā)光催化活性的Cr(Ⅲ), 通過毛細管電泳分離化學發(fā)光法檢測Cr(Ⅲ)間接地測定抗壞血酸的含量。電泳緩沖液由0.02 mol/L HAc-NaAc (pH 4.7) 和1×10-3mol/L EDTA溶液組成。對影響分離和檢測的各參數(shù)都進行了優(yōu)化實驗。抗壞血酸檢測限(3σ)為6×10-11mol/L。該方法具有簡單、靈敏度高、選擇性好等特點，可用于血液中痕量抗壞血酸的測定。

毛細管電泳； 化學發(fā)光； 抗壞血酸； 柱內還原

抗壞血酸(維生素C)是一種重要的維生素，其參與一系列重大的生理過程并涉及電子轉移反應，膠原蛋白的形成，抗氧化劑活性，鐵的吸收，細胞化合物的合成，羥基化作用以及芳香氨基酸的氧化分解代謝作用等?？箟难岬臏y定在臨床上，藥物以及食品應用上均具有重大的意義?？箟难岬臋z測通常的方法有：酶催化動力學光度法[1], 熒光動力學法[2-3]，毛細管電泳(CE)法[4]等。近年來，化學發(fā)光法(CL)測定抗壞血酸已有報道[5-7]，然而，化學發(fā)光法的缺點主要體現(xiàn)在缺乏選擇性。將高效率的毛細管電泳(CE)分離技術結合高靈敏度的(電)化學發(fā)光檢測已成為一種有效的分析方法[8]。

毛細管柱內電泳反應是指在高壓電場的作用下，利用分析物區(qū)帶在毛細管柱內的遷移速度與反應物質區(qū)帶的遷移速度不同，遷移速度大的物質區(qū)帶進入遷移速度小的物質區(qū)帶時, 兩個區(qū)帶物質間相互作用生成新物質的反應。其特點是反應過程在毛細管柱內在線完成并且與毛細管電泳的分離過程同時進行。由于毛細管柱內(In-capillary)反應技術較常規(guī)的毛細管柱前 (Pre-capillary) 或毛細管柱后 (Post-capillary)反應技術在重現(xiàn)性及靈敏度等方面均顯示出優(yōu)越性，因而受到極大的關注[9-12]。本工作提出了一種毛細管柱內反應-化學發(fā)光測定痕量抗壞血酸的新方法。采用毛細管柱內區(qū)帶穿通技術(Zone-passing Technique)，通過酸性重鉻酸鉀與抗壞血酸在毛細管柱內在線反應生成Cr(Ⅲ)離子，利用Cr(Ⅲ)離子催化Luminol-H2O2化學發(fā)光體系反應，實現(xiàn)柱后抗壞血酸的檢測。此方法測定抗壞血酸快速，簡便，靈敏度高，所得結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

毛細管電泳-化學發(fā)光分析儀由陜西師范大學化學化工學院實驗室組裝(圖1所示)。IFFM-A型化學數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司)。毛細管(河北永年光纖廠)：分離毛細管60 cm×75 μm I.D.；反應毛細管15 cm×530 μm I.D.；發(fā)光劑注射毛細管25 cm×250 μm I.D.。高速離心機(德國 Hermle 公司)；微超濾管(德國 Hermle 公司)。新毛細管使用前用0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl各沖洗10 min,然后再用二次蒸餾水沖洗,注入電泳緩沖液, 靜置24 h后備用。

魯米諾(分析純,陜西師范大學化學化工學院)5.0×10-2mol/L；過氧化氫(優(yōu)級純,上海桃浦化工廠)0.1 mol/L；抗壞血酸(分析純，西安化學試劑廠)配制成1×10-2moL/L的標準儲備液；NaOH-NaHCO3緩沖液：0.1 moL/L，用前稀釋適當濃度；HCl溶液：1 mol/L。

化學發(fā)光試劑：由0.1 mol/LNaBr、1×10-4mol/L EDTA、1×10-4mol/L的魯米諾以及1×10-2mol/L過氧化氫溶液的NaHCO3-NaOH的緩沖液(pH 11.5)組成的混合溶液?；瘜W發(fā)光試劑溶液通過氣動毛細管均勻地注入反應毛細管中。電解緩沖溶液：含1×10-3mol/L EDTA的0.02 mol/L的HAc-NaAc緩沖液。

所有的溶液都用0.45 μm的膜過濾并用超聲處理過。

圖1 毛細管電泳-化學發(fā)光分析儀示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the CE-CL detector system

1.高壓電源；2.電解槽；3.Pt電極；4.檢測室；5.光電倍增管；6.放大器；7.計算機；8.反應毛細管；9.電泳毛細管；10.T型連接管；11.CL試劑毛細管；12.CL試劑；13.氣流管；14.氣流控制系統(tǒng)；15.N2高壓瓶；16.廢液。

1.2 實驗方法

2 結果與討論

2.1 CE在線分離模式

2Cr3++3C6H6O6+7H2O。

圖2 在線柱內反應和毛細管電泳分離模式Fig.2 The procedures of online in-capillary reaction and CE separation

a. 柱端溶液注入順序：樣品，鹽酸，重鉻酸鉀; b. 在電場作用下，樣品與酸性重鉻酸鉀柱內反應生成Cr(Ⅲ)離子的過程。

2.2 分離條件的選擇

實驗采用NaAc-HAc作為電解緩沖液，研究了其濃度及pH值對分離效果的影響。結果表明，隨著NaAc-HAc濃度的增加，分離度也隨著增加，但濃度過大時，因保留時間也隨之增加導致分子擴散引起峰展寬，分離度反而下降，因此選擇NaAc-HAc的濃度為20 mmol/L。pH值為3～6時，隨著pH的增加，分離度增大，但pH值過大時，體系的離子強度增大，導致基線不穩(wěn)，不利于檢測；所以選用pH=5.5左右。又研究了電泳電壓對分離效果的影響，實驗結果表明，電壓較低時，分離時間長；隨著電泳電壓的增大，電流值也隨之增大，體系的焦耳熱明顯增大，影響分離的重現(xiàn)性和檢測。本實驗采用的分離電壓為15 kV。

2.3 化學發(fā)光條件的選擇

2.3.1 Luminol溶液及其pH值的影響 實驗表明，當采用NaOH-NaHCO3緩沖溶液作介質時，體系穩(wěn)定性好，且當pH值在11.5左右時，發(fā)光強度最好，故本實驗選用pH值為11.5的NaOH-NaHCO3緩沖溶液作為Luminol及化學發(fā)光反應的介質。

2.3.2 發(fā)光試劑濃度的影響及其穩(wěn)定性 實驗表明，隨著魯米諾濃度的增加，發(fā)光信號增強。當魯米諾濃度為5×10-4mol/L, 發(fā)光信號最強，再繼續(xù)增大魯米諾濃度，發(fā)光信號反而降低。實驗表明，隨H2O2濃度改變出現(xiàn)最大峰值發(fā)光信號對應的H2O2濃度為0.01 mol/L。對發(fā)光反應試劑的穩(wěn)定性進行考察，實驗表明，魯米諾與過氧化氫的混合溶液在10 h內對反應發(fā)光強度的測定無影響，超過10 h后發(fā)光強度值略有降低。而發(fā)光反應試劑穩(wěn)定在10 h以內足以滿足分析測試所需的時間。

圖3 空白液(a)和抗壞血酸(b)的電泳圖譜Fig.3 The electrophoregrams for the blank(a) and ascorbic acid(b)

2.4 干擾實驗

實驗表明，在以20 mmol/L HAc-NaAc及1×10-3mol/L EDTA為電解液的電泳體系中，對于1×10-9mol/L濃度的抗壞血酸溶液，常見金屬離子的干擾情況如下：1 000倍量的Pb2+、Ca2+、Al3+、Hg2+，100倍量的Ni2+、Zn2+、Cd2+、Mg2+、Ba2+、Mo(Ⅵ)、Cu2+、Mn2+、Fe3+不干擾測定，1倍量的Cr3+產(chǎn)生正峰，但其遷移時間先于抗壞血酸，因而不干擾抗壞血酸的測定。

2.5 工作曲線、檢測限和精密度

在最佳條件下, 測定抗壞血酸的線性范圍為1.0×10-10～1.0×10-8mol/L, 線性方程為Y=53.1+1.78×1010X, 相關系數(shù)R=0.993。抗壞血酸的檢測限為6.0×10-11mol/L。對1×10-9mol/L 的抗壞血酸進行5次測定，遷移時間的相對標準偏差(%)為2.6, 峰高的相對標準偏差(%)為4.5。

2.6 分析方法的應用

取2 mL健康成人血樣于微超濾離心管中，在離心機上以10 000 r/min離心10 min后，血漿中的蛋白質等大分子被超濾除去，得到無色血清，然后按實驗方法測定血清中抗壞血酸的含量。樣品圖譜如圖4。分析結果列于表1。

圖4 血清樣品電泳圖譜Fig.4 The electrophoregram for the blood serum a.未知峰；b.抗壞血酸峰。

表1 血樣中抗壞血酸的測定值*Tab.1 Determination of ascorbic acid in blood serum

*三次實驗結果的平均值；D為相對標準偏差。

3 結論

建立了一種毛細管電泳柱內反應-化學發(fā)光檢測血樣中痕量抗壞血酸的新方法。此方法利用毛細管電泳分離的同時，在毛細管柱內以Cr(Ⅵ)作為氧化劑在線氧化抗壞血酸生成對Luminol-H2O2化學發(fā)光體系具有催化活性的Cr(Ⅲ)離子，進而柱后間接測定抗壞血酸。此方法用于血樣中抗壞血酸的測定，靈敏度高，選擇性好，所得結果令人滿意。

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〔責任編輯 王 勇〕

Determination of ascorbic acid based on the combination of capillary electrophoresis and chemiluminescence

YANG Weiping1，ZHENG Xingwang2

(1 School of Ethnic Education，Shaanxi Normal University, Xi′an 710062, Shaanxi, China; 2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

A sensitive method for the determination of ascorbic acid based on the combination of electrophoresis separation and chemiluminescence was developed.The method was based on the reduction of Cr(Ⅵ) to Cr(Ⅲ) with ascorbic acid occurring inside the capillary and the light emission produced by luminol oxidation by hydrogen peroxide in basic aqueous solution catalyzed by Cr(Ⅲ).Running buffer was composed of 0.02 mol/L HAc-NaAc (pH 4.7) with 1×10-3mol/L EDTA,and parameters affecting CE-CL separation and detection were optimized.The limit of detection for ascorbic acid (3σ) was 6×10-11mol/L.This method offered potential advantages of simplicity, sensitivity, selectivity and applicability to the determination of ascorbic acid in blood samples.

capillary electrophoresis； chemiluminescence； ascorbic acid； in-capillary reaction

1672-4291(2015)03-0043-04

10.15983/j.cnki.jsnu.2015.03.331

2014-12-20

國家自然科學基金資助項目(111752670)

楊維平，男，教授，主要研究方向為毛細管電泳及發(fā)光分析。E-mail:wpy@snnu.edu.cn

O657.3

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