劉江月(濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東濰坊261053)

梓醇抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞炎癥反應(yīng)及RAGE表達*

劉江月△
(濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東濰坊261053)

［摘要］目的:研究梓醇對晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用并探討其可能機制。方法:將常規(guī)培養(yǎng)的EA.hy926細(xì)胞隨機分為對照組、梓醇對照組、AGEs組以及梓醇高劑量(0.5 mmol/L)、中劑量(0.25 mmol/L)和低劑量(0.05 mmol/L)保護組。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的生成; RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)及晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的mRNA及蛋白的表達。結(jié)果:梓醇保護組ROS生成均明顯減少，MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA及蛋白表達均顯著降低，RAGE蛋白表達明顯受抑制，且呈劑量依賴性(P＜0.05)。結(jié)論:梓醇能夠有效抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，其機制可能與其降低RAGE表達有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］梓醇;氧化應(yīng)激;炎癥反應(yīng);晚期糖基化終產(chǎn)物受體

糖尿病大血管病變是是糖尿病相關(guān)心腦血管疾病的基礎(chǔ)，基本病理改變是動脈粥樣硬化。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)、脂類的氨基與糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖化氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，與糖尿病大血管病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究已經(jīng)證實AGEs最主要的致病機制是與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)相互作用所介導(dǎo)的，AGEs能明顯增強內(nèi)皮細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及細(xì)胞間黏附分子1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達，抗RAGE抗體及sRAGE阻斷RAGE能明顯抑制這些黏附分子表達［1-2］。同時有研究顯示在AGEs-RAGE相互作用誘導(dǎo)的糖尿病血管病變中，大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的誘導(dǎo)生成是關(guān)鍵步驟［3-4］。梓醇是從地黃塊根中提取的小分子環(huán)烯醚萜類化合物［5］，具有多種藥理學(xué)作用如降血糖、抗腫瘤、保護神經(jīng)［6-8］等。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠抑制ROS生成減輕糖尿病大血管損傷［9］。本研究通過觀察梓醇是否能抑制RAGE的生成，降低AGEs-RAGE相互作用誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生，進而是否減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

材料和方法

1材料

1.1細(xì)胞株與藥物人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購自上海拜力生物科技有限公司;梓醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購于上海銘睿科技有限公司。

1.2主要試劑AGEs(Merk) ; DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco) ;胎牛血清(HyClone) ;胰蛋白酶(Sigma) ; 2'，7'-二氯熒光素雙乙酸鹽(DCFH-DA)試劑盒、Western blot相關(guān)試劑及MCP-1、TNF-α、VCAM-1、RAGE RT-PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所) ; MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE I抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3主要儀器752型紫外分光光度計(上海精密儀器有限公司) ; DYCZ-25D型電泳儀(北京市六一儀器廠) ; Bio-Rad型濕轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad) ;激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

2方法

2.1激光共聚焦顯微鏡觀察EA.hy926細(xì)胞ROS的生成生長良好的EA.hy926細(xì)胞接種于6孔板，實驗分為對照組(A組)、梓醇組(B組，0.5 mmol/L)、AGEs組(C組，200 mg/L)以及高劑量(D組，0.5 mmol/L)、中劑量(E組，0.25 mmol/L)和低劑量(F組，0.05 mmol/L)梓醇保護組。除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育4 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養(yǎng)30 min，棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，用無血清培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋DCFH-DA，按照細(xì)胞培養(yǎng)液量的一半加入細(xì)胞，37℃孵育30 min。無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，488 nm激光激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

2.2 RT-PCR檢測梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE的mRNA表達

將生長良好的EA.hy926細(xì)胞接種于6孔板，除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按說明書操作提取總RNA，合成cDNA，2 μL的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，進行PCR擴增，引物設(shè)計見表1。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.3Western blot檢測梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE蛋白的表達

將生長良好的EA.hy926細(xì)胞接種于6孔板，除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后切取目的條帶進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加I抗(1∶500)，4℃過夜，TBST漂洗3次，加入II抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影定影，圖像分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較組間差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞ROS生成的影響

與A組比較，B組的ROS生成無明顯變化，C組的ROS生成顯著增加(P＜0.05) ;與C組比較D、E、F各組的ROS均明顯降低(P＜0.05)，與E組比較，D組的ROS生成明顯減少(P＜0.05)，而F組的ROS生成明顯增多(P＜0.05)，說明梓醇對EA.hy926細(xì)胞ROS的生成無影響，對AGEs誘導(dǎo)的EA. hy926細(xì)胞生成ROS呈明顯劑量依賴性抑制作用，見圖1。

Figure 1.The effect of catalpol on ROS production in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖1梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

2梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達的影響

與A組比較，B組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1 的mRNA表達均無明顯變化(P＜0.05)，C組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達均顯著增高;與C組比較，D、E、F各組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達均明顯減少(P＜0.05) ;與E組比較，D組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達明顯降低(P＜0.05)而F組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖2。

3梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響

與A組比較，B組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均無明顯變化(P＜0.05)，C組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均顯著升高;與C組比較，D、E、F各組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均明顯減少(P＜0.05) ;與E組比較，D組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達明顯降低(P＜0.05)而F組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖3。

Figure 2.The effect of catalpol on the mRNA expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖2梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達的影響

4梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞RAGE的mRNA及蛋白表達的影響

與A組比較，B組RAGE的mRNA及蛋白表達無明顯變化，C組RAGE的mRNA及蛋白表達均明顯上調(diào)(P＜0.05) ;與C組比較，D、E、F組RAGE的mRNA及蛋白表達均明顯受抑制(P＜0.05) ;與E組比較，D組RAGE的mRNA及蛋白表達明顯受抑制(P＜0.05)而F組RAGE的mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞RAGE的mRNA及蛋白表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖4、5。

討論

AGEs在糖尿病中研究較多，體內(nèi)AGEs慢性蓄積與動脈粥樣硬化之間有明顯因果關(guān)系，是糖尿病血管病變的觸發(fā)因素［10-12］。RAGE是存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的AGEs特異性受體，它與AGEs的結(jié)合可引起內(nèi)皮細(xì)胞多種功能障礙，是引起糖尿病血管疾病的重要因素［13］。AGEs與RAGE結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和ROS產(chǎn)生增加，本研究也發(fā)現(xiàn)AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞RAGE表達明顯升高同時細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生。Choi等［14］研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞ROS的大量生成;楊清俊等［15］研究也發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。本研究采用不同濃度梓醇進行干預(yù)，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)梓醇呈劑量依賴性抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，這與我們的前期結(jié)果及前人的研究是一致的［9］。Choi等［14］研究表明梓醇明顯抑制RAGE表達，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)梓醇呈劑量依賴性抑制RAGE的表達，說明梓醇可能是通過抑制RAGE表達，阻斷了AGEs-RAGE的相互作用，從而抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS的大量生成，抑制氧化應(yīng)激。

Figure 3.The effect of catalpol on the protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖3梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of catalpol on the mRNA expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖4梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞RAGE mRNA表達的影響

Figure 5.The effect of catalpol on the protein expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖5梓醇對AGEs誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞RAGE蛋白表達的影響

AGEs-RAGE的相互作用能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，ROS產(chǎn)生增強，產(chǎn)生的ROS反過來又激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過級聯(lián)放大反應(yīng)，進一步調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄表達，其中大多數(shù)是與炎癥、免疫及動脈粥樣硬化相關(guān)的，如細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)、生長因子(TGF-β、VEGF、IGF、PDGF)、黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)和組織因子(tissue factor，TF)，促進糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展［16］。多項研究發(fā)現(xiàn)［14，17］梓醇能抑制多種細(xì)胞炎癥因子的釋放，本研究發(fā)現(xiàn)梓醇劑量依賴性地抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA和蛋白的表達。因此，我們推測梓醇抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機制可能與其抑制AGEs誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞RAGE表達，阻斷AGEs-RAGE相互作用，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

［參考文獻］

［1］Wendt T，Harja E，Bucciarelli L，et al.RAGE modulates vascular inflammation and atherosclerosis in a murine model of type 2 diabetes［J］.Atherosclerosis，2006，185(1) : 70-77.

［2］Matsui T，Oda E，Higashimoto Y，et al.Glyceraldehydederived pyridinium (GLAP) evokes oxidative stress and inflammatory and thrombogenic reactions in endothelial cells via the interaction with RAGE［J］.Cardiovasc Diabetol，2015，14: 1.

［3］Wautier MP，Chappey O，Corda S，et al.Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2001，280(5) : E685-E694.

［4］Basta G，Lazzerini G，Del Tureo S，et al.At least 2 distinct pathways generating reactive oxygen species mediate vascular cell adhesion molecule-1 induction by advanced glycation end products［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(7) : 1401-1407.

［5］董炤，陳長勛.梓醇藥理作用的研究進展［J］.中成藥，2013，35(5) : 1047-1051.

［6］Huang WJ，Niu HS，Lin MH.Antihyperglycemic effect of catalpol in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.J Nat Prod，2010，73(6) : 1170-1172.

［7］Garcia C，Leon LG，Pungitore CR，et al.Enhancemet of antiprolifter activity by molecular simplification of catalpol ［J］.Bioorg Med Chem，2010，18(7) : 2515-2513.

［8］Xu G，Xiong Z，Yong Y，et al.Catalpol attenuates MPTP induced neuronal degeneration of nigrol-striatal dopaminergic pathway in mice through elevating glial cell derived neurotrophic factor in striatum［J］.Neuroscience，2010，167(1) : 174-184.

［9］劉江月.梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護作用與抗氧化機制研究［J］.中國病理生理雜志，2014，30(6) : 1023-1028.

［10］Aronson D.Hyperglycemia and the pathobiology of diabetic complications［J］.Adv Cardiol，2008，45(7) : 1-16.

［11］Goldin A，Beckman JA，Schmidt AM，et al.Advanced glycation end products: sparking the development of diabetic vascular injury［J］.Circulation，2006，114 (6) : 597-605.

［12］Yoon SJ，Park S，Shim CY，et al.Association of RAGE gene polymorphisms with coronary artery disease in the Korean population［J］.Coron Artery Dis，2007，18(1) : 1-8.

［13］Wei Q，Ren X，Jiang Y，et al.Advanced glycation end products accelerate rat vascular calcification through RAGE/oxidative stress［J］.BMC Cardiovasc Disord，2013，13: 13.

［14］Choi HJ，Jang HJ，Chung TW，et al.Catalpol suppresses advanced glycation end-products-induced inflammatory responses through inhibition of reactive oxygen species in human monocytic THP-1 cells［J］.Fitoterapia，2013，86: 19-28.

［15］楊清俊，李宗澤，朱艷凌，等.梓醇對高糖誘導(dǎo)SHSY5Y細(xì)胞凋亡的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，2013，29(3) : 43-46.

［16］Basta G，Schmidt AM，De Caterina R.Advanced glycation end products and vascular inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes［J］.Cardiovasc Res，2004，63(4) : 582-592.

［17］Kim HM，An CS，Jung KY，et al.Rehmannia glutinosa inhibits tumour necrosis factor-alpha and interleukin-1 secretion from mouse astrocytes［J］.Pharmacol Res，1999，40(2) : 171-176.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Inhibitory effect of catalpol on inflammation and expression of RAGE in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products

LIU Jiang-yue
(Department of Pathophysiology，Weifang Medical College，Weifang 261053，China.E-mail: jiangyue7879@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the inhibitory effect of catalpol on inflammation in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products (AGEs) and to explore its antioxidant mechanisms.METHODS: Human endothelial cell line EA.hy926 was cultured and randomly divided into control group，catalpol (0.5 mmol/L) group，AGEs group，highdose (0.5 mmol/L) catalpol+ AGEs group，middle-dose (0.25 mmol/L) catalpol+ AGEs group and low-dose (0.05 mmol/L) catalpol+ AGEs group.Intracellular reative oxygen species (ROS) production was detected by laser scanning confocal microscopy.The levels of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in culture supernatant were detected by commercial ELISA kits.The expression of MCP-1，TNF-α，VCAM-1 and receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the EA.hy926 cells were detected by Western blot.RESULTS: In high-dose catalpol+ AGEs and middle-dose catalpol+ AGEs groups，the generation of ROS was decreased significantly.The levels of MCP-1，TNF-α and VCAM-1，and protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 were significantly lower.The expression of RAGE protein in EA.hy926 cells were significantly inhibited (P ＜0.05).CONCLUSION: Catalpol effectively inhibits the AGEs-induced oxidative stress and inflammation in EA.hy926 cells，which may be associated with a decrease in the expression of RAGE.

［KEY WORDS］Catalpol; Oxidative stress; Inflammation; Receptor for advanced glycation end products

通訊作者△Tel: 0536-8462020; E-mail: jiangyue7879@126.com

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目(No.8130068) ;山東省自然科學(xué)基金資助項目(No.ZR2009CQ013) ;山東省中醫(yī)藥管理局資助項目(No.2013-237)

［收稿日期］2015-02-02［修回日期］2015-03-17

［文章編號］1000-4718(2015)09-1693-06

［中圖分類號］R543.1; R363

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.029