應(yīng)　曉，王再紅，王振華(衢州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江衢州324002)

miR-193b體外協(xié)同增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)

應(yīng)曉△，王再紅，王振華
(衢州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江衢州324002)

［摘要］目的:研究微小RNA(microRNA，miR) -193b是否能增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效力及機(jī)制。方法:用real-time PCR方法檢測(cè)乳腺癌患者及健康對(duì)照者血漿中的miR-193b表達(dá)水平。MTT法檢測(cè)miR-193b聯(lián)合多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的殺傷效力。利用生物信息學(xué)、real-time PCR及Western blot方法驗(yàn)證miR-193b是否調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)。構(gòu)建Mcl-1真核表達(dá)載體，MTT法檢測(cè)Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)miR-193b聯(lián)合多柔比星治療乳腺癌療效的影響。結(jié)果:乳腺癌患者血漿中miR-193b表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。miR-193b聯(lián)合多柔比星治療組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷效力顯著高于多柔比星單治療組。miR-193b轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231細(xì)胞Mcl-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降。miR-193b聯(lián)合多柔比星在Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性顯著低于未轉(zhuǎn)染Mcl-1表達(dá)載體的miR-193b聯(lián)合多柔比星組。結(jié)論: miR-193b通過(guò)靶向于Mcl-1增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效力。

［關(guān)鍵詞］微小RNA-193b; Mcl-1;乳腺癌; MDA-MB-231細(xì)胞;多柔比星

乳腺癌在女性中是世界上發(fā)病率最高的腫瘤。盡管如今腫瘤治療手段已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，乳腺癌的5年存活率卻仍然較低［1］。多柔比星是目前最主要的抗腫瘤藥物之一，能有效治療乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤等［2-4］。以多柔比星為主的化療方案在腫瘤治療中越來(lái)越被重視，然而目前亟待解決的問(wèn)題就是如何選用最佳的輔助藥物以取得最好的療效并降低多柔比星的耐藥性［4］。MicroRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'UTR)配對(duì)結(jié)合下調(diào)靶基因的表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)microRNA的失調(diào)和腫瘤發(fā)生有關(guān)［5］。MicroRNA-193b (miR-193b)被報(bào)道與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥產(chǎn)生有關(guān)［6-7］，然而miR-193b在乳腺癌中發(fā)揮何種生物作用目前仍不清楚，本研究的目的在于探討miR-193b是否在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，并研究miR-193b是否能增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性。

材料和方法

1患者資料

收集24例2012年1月～2015年1月乳腺癌患者的血漿，患者年齡34～68歲(平均年齡48.7歲)，另取23例經(jīng)診斷未罹患乳腺癌的就診患者的血漿作為陰性對(duì)照，對(duì)照患者年齡31～68歲(平均年齡49.3歲)，均取得患者的知情同意。

2材料

多柔比星、噻唑藍(lán)［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于Sigma; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Gibco;細(xì)胞蛋白提取液購(gòu)于江蘇碧云天;兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin購(gòu)于CST; miR-193b模擬物和陰性對(duì)照寡核苷酸(negative control oligonucleotide，NCO)購(gòu)于上海吉瑪生物; miR-193b模擬物序列為5'-AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU-3'; NCO序列為5'-CUCGCCGUAACACUCCGGCUAA-3'。TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1和Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen; SYBR Green試劑購(gòu)于TaKaRa; PVDF膜購(gòu)于Millipore; ECL試劑盒購(gòu)于Pierce。各PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購(gòu)于ATCC。MDA-MB-231細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。

3.2Real-time PCR檢測(cè)miR-193b的表達(dá)血漿總RNA用TRIzol試劑提取。miR-193b的逆轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)real-time PCR法［8］。將U6作為內(nèi)參照，miR-193b的相對(duì)表達(dá)由2－ΔΔCt法計(jì)算［9］。miR-193b逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCGGGAC-3'; U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

3.3Real-time PCR檢測(cè)Mcl-1的表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞總RNA用TRIzol試劑提取。cDNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說(shuō)明步驟由總RNA合成。Mcl-1的定量PCR擴(kuò)增使用SYBR Green試劑，GAPDH作為內(nèi)參照，Mcl-1的相對(duì)表達(dá)由2－ΔΔCt法計(jì)算。Mcl-1的上游引物為5'-TGGCTAAACACTTGAAGACC-3'，下游引物為5'-GGAAGAACTCCACAAACCC-3'; GAPDH的上游引物為5'-CCACTCCTCCACCTTTG-3'，下游引物為5'-CACCACCCTGTTGCTGT-3'。

3.4質(zhì)粒構(gòu)建將Mcl-1基因cDNA全長(zhǎng)序列(Gene ID: NM_001197320)以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒［10］。

3.5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說(shuō)明書(shū)步驟將miR-193b (50 nmol/L)，pc-DNA3.1-Mcl(2 mg/L)轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，用細(xì)胞蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液用12.5% SDSPAGE進(jìn)行分離，將電泳分離膠通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用Mcl-1或β-actin單克隆抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的Ⅱ抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

3.7MTT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性將MDA-MB-231細(xì)胞按5×103cells/well接種在96孔板上。將miR-193b轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，孵育24 h，然后再加不同濃度多柔比星培養(yǎng)48 h。加入20 mL MTT (5 g/L)培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，振蕩后再570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值。細(xì)胞活力結(jié)果用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的A值比值表示。

3.8細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將miR-193b轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中，孵育24 h，然后再加2 μmol/L多柔比星培養(yǎng)48 h。之后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將PI和Annexin V加入細(xì)胞中孵育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用非配對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1乳腺癌患者血漿miR-193b表達(dá)水平下降

人乳腺癌血漿的miR-193b表達(dá)量顯著低于對(duì)照患者血漿標(biāo)本，提示miR-193b可能對(duì)乳腺癌發(fā)揮腫瘤抑制作用，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The plasma level of miR-193b in human breast cancer patients or normal controls.Mean±SD.n=24.*P＜0.05 vs normal controls.圖1乳腺癌患者及對(duì)照組血漿miR-193b表達(dá)水平

2 miR-193b增強(qiáng)多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性

miR-193b轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)miR-193b水平顯著升高(圖2)。miR-193b聯(lián)合多柔比星治療組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性顯著高于同濃度多柔比星單治療組(圖3)。這提示miR-193b可顯著增強(qiáng)多柔比星對(duì)乳腺癌的治療效果。

Figure 2.Relative expression of miR-193b in MDA-MB-231 cells transfected with miR-193b mimic or NCO.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCO group.圖2 MDA-MB-231細(xì)胞用miR-193b或NCO轉(zhuǎn)染后的miR-193b相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3.miR-193b significantly enhanced the cytotoxiciy of doxorubicin for MDA-MB-231 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs doxorubicin+ NCO group.圖3 miR-193b顯著增強(qiáng)多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性

3 Mcl-1是miR-193b的直接靶點(diǎn)

生物信息學(xué)(http://www.targetscan.org/)結(jié)果表明Mcl-1可能是miR-193b的靶點(diǎn)(圖4)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-193b轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后Mcl-1的表達(dá)量無(wú)論在mRNA水平上還是蛋白水平上，都顯著低于未轉(zhuǎn)染miR-193b組，而多柔比星(2 μmol/L)對(duì)Mcl-1的表達(dá)無(wú)影響，見(jiàn)圖5。

Figure 4.TargetScan 6.2 software predicted that Mcl-1 is the putative target of miR-193b.圖4 TargetScan 6.2預(yù)測(cè)Mcl-1是miR-193b的靶基因

4 miR-193b通過(guò)Mcl-1/凋亡途徑增強(qiáng)多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性

將miR-193b和pcDNA3.1-Mcl-1共轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中檢測(cè)Mcl-1的表達(dá)，由于pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒不存在3' UTR序列，因此pcDNA3.1-Mcl-1能對(duì)抗miR-193b對(duì)Mcl-1的下調(diào)作用(圖6)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果則發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-Mcl-1的共轉(zhuǎn)染顯著抑制了miR-193b聯(lián)合多柔比星(2 μmol/L)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性(圖7)，同時(shí)pcDNA3.1-Mcl-1的共轉(zhuǎn)染可顯著抑制miR-193b聯(lián)合多柔比星(2 μmol/L)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)(圖8)。這些結(jié)果提示miR-193b增強(qiáng)多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Mcl-1的表達(dá)水平。

Figure 5.Transfection of miR-193b significantly decreased the expression of Mcl-1 in MDA-MB-231 cells at mRNA and protein levels.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCO group.圖5轉(zhuǎn)染miR-193b顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞Mcl-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

Figure 6.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the down-regulation of Mcl-1 caused by miR-193b in MDA-MB-231 cells at mRNA and protein levels.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ pcDNA3.1-empty group.圖6 pcDNA3.1-Mcl-1拮抗miR-193b對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Mcl-1表達(dá)水平的下調(diào)

Figure 7.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the viability inhibition of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin (2 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ doxorubicin group.圖7 pcDNA3.1-Mcl-1拮抗miR-193b聯(lián)合多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用

討論

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)相比于正常對(duì)照組，乳腺癌患者血漿中的miR-193b表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示miR-193b可能起腫瘤抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道表明miR-193b在其它各種腫瘤類型中也同樣發(fā)揮抗腫瘤作用，如miR-193b的低表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［11］，而在胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-193b則能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡［7］，這些報(bào)道和本研究的結(jié)果都提示miR-193b可能是一個(gè)抑癌基因。

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中一個(gè)重要的抗凋亡蛋白成員，它的高表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的不良預(yù)后和多藥耐藥密切相關(guān)［12］。腫瘤細(xì)胞中Mcl-1的高表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力和對(duì)細(xì)胞毒性化療藥物的抵抗力，因此腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著Mcl-1表達(dá)的增加［13］。

多柔比星是目前腫瘤化療的一線藥物之一，盡管多柔比星的療效很好，但是隨著多柔比星的反復(fù)使用，腫瘤細(xì)胞會(huì)逐漸產(chǎn)生對(duì)多柔比星的耐藥性。為了提高多柔比星的療效，以多柔比星為主的聯(lián)合用藥方案被廣泛用于治療多種腫瘤，如多柔比星聯(lián)合紫杉醇或吉西他濱等都被證明能推遲腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥，提高化療效果［14-15］。然而將多柔比星和microRNA聯(lián)合用藥治療腫瘤目前的研究仍不充分。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)miR-193b可顯著提高多柔比星對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效力，通過(guò)生物信息學(xué)，體外轉(zhuǎn)染miR-193b等方法進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1是miR-193b的靶點(diǎn)。構(gòu)建Mcl-1表達(dá)載體并在MDA-MB-231細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Mcl-1后，miR-193b對(duì)多柔比星的協(xié)同抗腫瘤作用喪失，表明miR-193b增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星敏感性的分子機(jī)制可能是降低細(xì)胞內(nèi)Mcl-1的表達(dá)。綜上所述，miR-193b/Mcl-1途徑與多柔比星的抗乳腺癌活性密切相關(guān)，它可能成為腫瘤化療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

Figure 8.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin (2 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ doxorubicin group.圖8 pcDNA3.1-Mcl-1抑制miR-193b聯(lián)合多柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅森)

miR-193b enhances cytotoxicity of doxorubicin by targeting Mcl-1 in breast cancer

YING Xiao，WANG Zai-hong，WANG Zhen-hua
(Clinical Laboratory，Quzhou Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Quzhou 324002，China.E-mail: qzyingxiao@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of microRNA (miR) -193b on doxorubicin therapy in breast cancer in vitro.METHODS: miR-193b level in plasma was detected by real-time PCR in the patients with breast cancer or the healthy controls.MTT assay was performed to measure the inhibitory effect of miR-193b plus doxorubicin on the growth of MDA-MB-231 cells.Bioinformatics，real-time PCR and Western blot were performed to determine whether the expression of Mcl-1 was regulated by miR-193b.Mcl-1 expression vector was constructed，and the role of Mcl-1 vector toward miR-193b plus doxorubicin-induced cytotoxicity in MDA-MB-231 cells was observed by MTT assay.RESULTS: Down-regulation of miR-193b was found in breast cancer patients.The miR-193b plus doxorubicin group showed a higher growth inhibition than cisplation group in MDA-MB-231 cells.The expression of Mcl-1 at both mRNA and protein levels was down-regulated after miR-193b transfection.The growth inhibition of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin was significantly decreased after the transfection of Mcl-1 expression vector.CONCLUSION: miR-193b sensitizes doxorubicininduced cytotoxicity by targeting Mcl-1 in breast cancer.

［KEY WORDS］MicroRNA-193b; Mcl-1; Breast cancer; MDA-MB-231 cells; Doxorubicin

通訊作者△Tel: 0570-3086237; E-mail: qzyingxiao@163.com

［收稿日期］2015-04-23［修回日期］2015-05-15

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1584-05

［中圖分類號(hào)］R735.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.009